1. 硫酸铵沉淀到底能否把蛋白按分子量分开？ 硫酸氨沉淀的机理其实就是盐析（salt out）。一般而言蛋白质在溶液里面溶解度和盐浓度有关系。在低盐浓度下，如果增加盐浓度，会增强蛋白质的溶解，这是因为，盐的离子与蛋白质表面的正负电荷配对，减少了蛋白质电荷表面相互作用的机会。当盐浓度高到一定程度的时候，过多的盐会跟蛋白质疏水表面争夺水分子， 以至于蛋白质疏水表面倾向于相互作用形成聚合物沉淀下来。
相对来说，分子量大的蛋白质量比较容易发生沉淀，但实际上影响因素很多,比如溶液PH,蛋白浓度,有无非蛋白质成分等,而分子量只是众多影响因素之一。因此，想根据蛋白质分子量的不同利用硫酸氨沉淀将其分开,不是可取的方法。
盐析法是利用抗体与杂质蛋白蛋白对盐浓度的敏感程度的差异来进行分离。实际上就是利用溶解度的差异进行分离。拿抗体溶液来说，当硫酸铵饱和溶液达到20%时，纤维素蛋白首先析出，当28%-33%大部分优球蛋白析出当33%-50%时球蛋白析出，大于50%其他杂蛋白析出。从这几种蛋白的析出顺序看，好像与蛋白的分子量有一定的关系，优球蛋白分子量达到上千亿，球蛋白（IgG）十几万，分子量相差太悬殊了，从化学的角度看，对于同数量级别的分子来说，其溶解度与分子量是没有太大关系的。所以想把不同分子量的蛋白分离开比较费劲。
2. 酶在盐析时上清和沉淀中酶活差不多一样高;在与酶等电点相同的缓冲液中透析24hrs后,酶活基本丧失;还有，对透析后的沉淀用提取液溶解,有不溶物,为什么？缓冲液pH选的对不?沉淀是用提取液溶解吗？
酶在盐析时上清和沉淀中酶活差不多一样高,说明盐浓度不够，应增加盐的浓度，使酶大部分沉淀下来，直到上清中检测不到该酶为止。或者考虑一下过高的盐离子会不会影响酶活测定。
盐浓度越高，对蛋白质活性的影响越大，也会有越多的不溶蛋白质（当然也包括杂蛋白和其他杂质），这是计算收率时需要考虑的。
缓冲液的ph值和体积也会影响蛋白质的溶解度。酶在等电点最易沉淀，应选离等电点较远的缓冲液进行透析，而且要保证缓冲液的ｐＨ值在该酶的稳定ｐＨ范围内，这样才不易使酶失活。
盐析沉淀的蛋白质最好立即进行脱盐处理（超滤或者G25），透析好像太慢了，特别是对于酶）。沉淀用提取液溶解是可行的，但是选的提取液必须要是正确的才行，即能够提出目的酶！酶的透析也可在提取液中进行！
3. 盐析用盐的Ks值顺序是硫酸钠>硫酸铵，可是又在盐析感胶离子序中写到钠离子>铵离子，这是怎么回事呢？ Ks值与两个因素有关，一个是盐的性质，包括盐离子的离子价数和半径；一个是与蛋白质的性质有关，还与温度、pH值有关。所以感胶系数是单谈离子性质，而Ks 就广泛多了。公式：Ks=lgS/(beta*I)，其中S 是在离子强度为 I 时该蛋白的溶解度。beta 是在纯水中该蛋白的溶解度，在一定温度和pH值下是常数。
4. 如何使沉淀更加完全？ 沉淀要想比较完全,那需要在低温下放一段时间,只有这样那些小的沉淀才会很好聚集而上面的完全澄清,此外这也和浓度有关,浓度低些这样的现象更明显,沉淀后放4度过夜,那沉淀应该更完全了。
上一篇：盐析法应用 下一篇：超滤原理和优缺点
