| 亲和层析－亲和吸附剂 | 点击： 作者： 来源：基因酷 时间： 2007-11-08 本站论坛
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另外也可以通过进一步的活化处理，生成N－羟基琥珀酰亚胺酯、环氧基等活性基团直接与各种配体偶联。引入间隔臂的基质与配体结合时，配体就可以离开基质一定的空间，从而可以减少空间位阻效应，易于与待分离物质结合。
配体
配体的性质
亲和层析是利用配体和待分离物质的亲和力而进行分离纯化的，所以选择合适的配体对于亲和层析的分离效果是非常重要的。理想的配体应具有以下一些性质：
1. 配体与待分离的物质有适当的亲和力。亲和力太弱，待分离物质不易与配体结合，造成亲和层析吸附效率很低。而且吸附洗脱过程中易受非特异性吸附的影响，引起分辨率下降。但如果亲和力太强，待分离物质很难与配体分离，这又会造成洗脱的困难。总之，配体和待分离物质的亲和力过弱或过强都不利于亲和层析的分离。应根据实验要求尽量选择与待分离物质具有适当的亲和力的配体。
2. 配体与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性，也就是说配体与待分离物质有适当的亲和力，而与样品中其它组分没有明显的亲和力，对其它组分没有非特异性吸附作用。这是保证亲和层析具有高分辨率的重要因素。
3. 配体要能够与基质稳定的共价结合，在实验过程中不易脱落，并且配体与基质偶联后，对其结构没有明显改变，尤其是偶联过程不涉及配体中与待分离物质有亲和力的部分，对二者的结合没有明显影响。
4. 配体自身应具有较好的稳定性，在实验中能够耐受偶联以及洗脱时可能的的较剧烈的条件，可以多次重复使用。
完全满足上述条件的配体实际上很难找到，在实验中应根据具体的条件来选择尽量满足上述条件的最适宜的配体。
根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：特异性配体（specific ligand）和通用性配体（general ligand）。特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶和它的抑制剂、激素－受体等，它们结合都具有很高的特异性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。配体的特异性是保证亲和层析高分辨率的重要因素，但寻找特异性配体一般是比较困难的，尤其对于一些性质不很了解的生物大分子，要找到合适的特异性配体通常需要大量的实验。解决这一问题的方法是使用通用性的配体。通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体，如各种凝集素（lectine）可以结合各种糖蛋白，核酸可以结合RNA、结合RNA的蛋白质等。通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选择合适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具有结构稳定、偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等优点，所以在实验中得到了广泛的应用。
配体与基质的偶联
除了前面已经介绍了基质的一些活化基团外，通过对活化基质的进一步处理，还可以得到更多种类的活性基团。这些活性基团可以在较温和的条件下与含氨基、羧基醛基、酮基、羟基、硫醇基等多种配体反应，使配体偶联在基质上。另外通过碳二亚胺、戊二醛等双功能试剂的作用也可以使配体与基质偶联。以上这些方法使得几乎任何一种配体都可以找到适当的方法与基质偶联。关于配体和基质偶联的具体实验操作可以参阅本书后面的实验部分或相应的参考文献。
配体和基质偶联完毕后，必须要反复洗涤，以去除未偶联的配体。另外要用适当的方法封闭基质中未偶联上配体的活性基团，也就是使基质失活，以免影响后面的亲和层析分离。例如对于能结合氨基的活性基团，常用的方法是用2－乙醇胺、氨基乙烷等小分子处理。
配体与基质偶联后，通常要测定配体的结合量以了解其与基质的偶联情况，同时也可以推断亲和层析过程中对待分离的生物大分子吸附容量。配体结合量通常是用每毫升或每克基质结合的配体的量来表示。测定配体结合量的方法很多，下面简单介绍几种：
1. 差量分析：根据加入配体的总量减去配体与基质偶联后洗涤出来的量即可大致推算出配体的结合量。当配体可以用光谱法准确定量时，这种方法还是相当准确的。
2. 直接光谱测量：对于能够吸收250nm以上波长的配体，可以直接用光谱法测定与基质结合的配体的量。
3. 凝胶溶解：通过适当的方法将凝胶溶解，如75 ?C下与酸或碱作用，而后直接用光谱法测量。
4. 酸或酶的水解：用酸或酶作用，使得基质释放出配体或配体的裂解物进行分析。
5. 2,4,6－三硝基苯磺酸钠（TNBS）分析：利用TNBS与未结合配体和结合某些配体的基质作用呈现不同的颜色，可以计算出配体结合量
6. 元素分析：如果配体中含有某种特别的元素，通过元素分析就可以确定配体结合量。
7. 放射性分析法：偶联中加入一定量带有同位素的配体，通过放射性分析确定配体结合量，这是一种非常灵敏的方法。
影响配体结合量的因素很多，包括基质和配体的性质、基质的活化方法及条件、基质和配体偶联反应的条件等等。例如通常溴化氰活化的基质的活性基团比环氧基活化的基质多，配体结合量可能较大。在用溴化氰活化时，增加溴化氰的量及反应的pH，可以增加基质上活化基团的量，从而增大配体结合量。偶联过程中增加配体的量及增大反应的pH，也可以增大配体结合量。实验中通常希望配体结合量较高，但应注意增加配体结合量应根据实际情况，还要考虑到其它因素的影响。因为提高配体的结合量不等价于提高亲和吸附剂的吸附容量，配体结合量只是影响亲和吸附剂吸附容量的一个因素，还有很多因素，如基质、配体以及待分离物质本身的性质，配体在基质的结合情况以及后面要介绍的实验操作条件等都可能对亲和吸附剂的吸附容量产生很大的影响。例如增大配体的结合量通常可以增加吸附容量，但有些增大配体结合量的条件可能会影响配体的结构，降低配体和待分离物质的亲和力，这样反而会降低亲和吸附剂的吸附容量。实际影响亲和吸附剂吸附容量的因素是非常复杂的，各种因素的影响都不是绝对的，要获得较高的吸附容量往往要考虑很多因素，并通过实验摸索来选择合适的条件。
目前已有多种活化的基质以及偶联各种配体的亲和吸附剂制成商品出售，可以省去基质活化，配体偶联等复杂的步骤。使用方便，效果好，但一般价格昂贵。
亲和吸附剂的再生和保存
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