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离子交换层析常见问题分析

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-11-08 　本站论坛

1. 层析速度太慢
　　可能原因和解决方法：
　　关小层析柱出口，再打开；
　　若是起跑阻挡了洗柱缓冲液的流动，可通过增加柱压并用指甲轻巧柱壁的方法以除去气泡，确保在引入任何溶液是不要产生气泡；
　　树脂顶部出现沉淀物，此时应刮掉顶部1~2cm的树脂，换之以新的树脂。更加仔细的过滤蛋白质溶液或在层析时使用去垢剂；
　　树脂的支撑物发生粘连，在样品蛋白质损失量允许的情况下，支撑物应取出并清洗；
　　树脂被压紧，葡萄糖等随溶液离子强度的变化而膨胀的树脂可能会发生这一现象；
　　层析柱太细，对于性能好的树脂，柱高只需直径的两倍即可得到理想的层析效果；
　　细小颗粒堵塞了层析柱；
　　泵的连接管漏气，更换新的连接管；
　　层析柱出口处管道堵塞，更换或清洗管道；
　　树脂滋生微生物。
2. 蛋白质不与树脂结合
　　可能原因及解决方法：
　　初上样缓冲液离子强度过大，降低初始上样缓冲液离子强度；
　　树脂PH值因解析作用而发生变化，注意蛋白质等电点的计算值往往与实验值差别很大；
　　树脂未进行适当平衡；
　　再生的树脂未洗净。
3. 纯化的蛋白质产率低
　　可能原因及解决方法：
　　树脂上的蛋白质未洗净，可采用增强溶液离子强度，更换活性高的反荷离子或使用去垢剂等办法解决；
　　PH值不合适，若缓冲体系的PH值与目的蛋白的PI相差太远，目的蛋白与树脂的结合会过于牢固；
　　蛋白质发生沉淀，可能是因为缓冲体系PH值过于接近蛋白质PI值，溶液离子强度过低或溶液过渡稀释；
　　蛋白质在初步过滤的时候有损失；
　　蛋白质或者辅助因子在层析时有损失；
　　蛋白质水解酶破坏了目的蛋白；
　　树脂中有微生物。
4. 蛋白质分辨效果差
　　　可能原因及解决办法：
　　　层析时流速太快；
　　　层析柱过短；
　　　上柱蛋白过多；
　　　梯度洗脱时洗脱液浓度变化太快；
　　　蛋白质可在脱离层析柱后再次混合，尽量减少树脂支持物与部分收集期间的管道体积；
　　　不均匀的装柱以至产生碎屑，，上样合洗脱时的错误操作；
　　　树脂未进行适当平衡；
　　　树脂中有微生物。
5. 蛋白质洗脱的重现性差
　　可能原因及解决办法：
　　层析柱的平衡不彻底；
　　洗脱液的例子条件或PH值不一致；
　　蛋白质发生沉淀，彻底清洗层析柱，取出任何可能导致蛋白质沉淀的杂质，过滤蛋白质溶液；
　　蛋白质储存时变性，重新测定蛋白质活性，必要时改变蛋白质的储存条件；
6. 纯化时蛋白质失活
　　可能原因及解决办法：
　　某个辅助因子或一部分蛋白质有损失，混合部分收集液，测定活性；
　　蛋白质在现有层析液中不稳定；
　　树脂中有微生物。
7. 蛋白质活性高于纯化前
　　可能原因及解决办法：
　　测定条件发生改变；
　　某种抑制剂在纯化时去掉了，可混合部分收集液，测定活性以确定。

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