SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质

一、目的要求
1.学习电泳原理和技术
2.学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术
二、原理
  聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N，N—四甲基乙二胺(N，N，N，N—tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH₄)₂S₂O₈，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B₂，C₁₇H₂₀O₆N₄)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。
聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：
(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；
(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；
(3)对pH和温度变化较稳定；
(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；
(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g
(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；
(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。

凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。
表3.4  分子量范围与凝胶浓度的关系

聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。
目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)，两者电泳原理完全相同。

图1  聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A为正面,B为剖面)
(1)样品胶pH6.7      (2)浓缩胶pH6.7  (3)分离胶pH8.9  (4)电极缓冲液pH8.3

图2  夹心垂直板电泳槽示意图      图3  凝胶模示意图
1.样品槽模板  2.长玻璃板 1.导线接头 2.下贮槽  3.凹形橡胶框  4.样品槽模板  5.固定螺丝 6.上贮槽  7.冷凝系统

不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。

 图4 电泳过程示意图
A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子 B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。

图5 不连续系统浓缩效应示意图

SDS－聚丙烯酰胺凝胶