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SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质

点击： 作者： 来源：生物秀 时间： 2007-05-08 　本站论坛

电泳（SDS-PAGE）：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。

三、试剂与器材
试剂：10%SDS、凝胶贮液（30％ACr-0.8%Bis)、分离胶缓冲液（3.0 mol/L pH8.9Tris－HCl 缓冲液）、浓缩胶缓冲液（ 0.5 mol/L pH6.7Tris－HCl 缓冲液）、10%过硫酸铵、 10%TEMED、 pH8.3Tris-Gly电极缓冲液、 1%琼脂糖溶液、0.05％考马斯亮兰R250 、7%醋酸
器材：垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪、脱色摇床

四、操作方法
1.安装夹心式垂直板电泳槽
(1)装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。
(2)将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。
(3)将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。
(4)将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。
(5)竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂(糖)。其目的是封住空隙，凝固后的琼脂(糖)中应避免有气泡。
2 配胶
表 SDS–不连续体系凝胶的制备

3. 制备凝胶板
  将混合后的分离胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1 cm。用1 mL注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水(约3–4 mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。约30-60 min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。
  将上、下贮槽的蒸馏水倒去，将混合均匀后的浓缩胶溶液，用细长头的滴管加到长、短玻璃板的窄缝内(即分离胶上方)，距短玻璃上缘0.5 cm处，轻轻加入样品槽模板.在上、下贮槽中加入蒸馏水，但不能超过短玻璃板上缘。静置电泳槽，10 min左右，上胶即可聚合，再放置10-20 min，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5 cm，轻轻取出样品槽模板，即可加样。
4. 样品的处理及加样
   将样品按0.5–1 mg/mL加样品溶解液，溶解后，将其转移到带塞的小离心管中，轻轻盖上盖子(不要塞紧，以免加热时迸出)，在100℃沸水浴中加热3min，取出冷却后加样。
  用微量进样器取25 l上述混合液，通过缓冲液，小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部。
5 .电泳
  将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，接通冷却水，打开电泳仪开关，开始时电流为10 mA，待样品进入分离胶后，将电流调至20-30 mA，当溴酚蓝染料距硅胶框1 cm时，停止电泳，关闭电源及冷却水。
6 .染色与脱色
  电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅胶框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。加入染色液染色1-2 h，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。
7. 结果处理
  量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR:

五、注意事项
（1）安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，避免缓冲液渗漏。
（2）用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。
（3）样品中应含一定浓度的蔗糖溶液，目的是用以防止样品因对流而被稀释。
（4）加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。

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