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表达蛋白的生物学活性的检测

点击： 作者： 来源： 时间： 2006-11-07 　本站论坛

一、MTT比色法检测细胞活性
（一）原理
活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能催化无色的MTT形成蓝色的甲肷，其形成的量与活细胞数和功能状态呈正相关。对
细胞活力有影响的表达蛋白活性检测可以通过MTT比色法进行。
（二）试剂准备
1、青链霉素溶液（100X）：青霉素100万U，链霉素100万U，溶于100mlddH2O中, 抽滤除菌。
2、 L15基础培养基：1000mlL15培养基，加2g碳酸氢钠，10ml 100X青链霉素，5mlHEPES。
3、 MTT液：5mg/ml溶于L15基础培养基。
4、 SDS处理液：20gSDS，50μl二甲基甲酰胺，加双蒸水50ml溶解。
5、 L-多聚赖氨酸：50μg溶于1ml双蒸水中。
6、 L15基础培养基溶解的不同浓度的蛋白液。
（三）操作步骤（以背根神经节细胞培养为例）
1、无菌条件下取新生一天的SD大鼠背根神经节（DRG）。
2、镜下去除神经根和外膜，放入1ml 0.1%胶原酶中37℃消化30min，每5min摇匀一次。
3、洗去胶原酶，吹打分散后，接种于预先涂有L-多聚赖氨酸的96孔培养板中，每孔含100μl无血清L15培养基，细胞约
800个。
4、实验组分别加入纯化的表达蛋白（分别以不同的蛋白浓度），阴性对照加入等体积表达蛋白的溶剂。
5、 37℃ 5%CO2培养48hr后，每孔加入10μl MTT，37℃ 5%CO2孵育4hr。
6、加入100μl 20%的SDS处理液，37℃孵育20hr。
7、用EL×800微孔酶标仪测定OD570值，数据分析。
二、DRG无血清培养检测促神经生长作用
（一）操作步骤：
1、无菌条件下取新生一天的SD大鼠DRG。
2、镜下去除神经根和外膜，接种于预先涂有L-多聚赖氨酸的96孔培养板中，每孔1个DRG。
3、待DRG贴壁后加入100μl无血清L15基础培养基，实验组加入纯化的表达蛋白（分别以不同的蛋白浓度），阴性对照
加入等体积的溶解表达蛋白的溶剂。
4、37℃ 5%CO2培养，每天在Olympus倒置显微镜下观察细胞的生长情况，并进行测量，其数据作统计分析。
二、注意事项
1、MTT有毒，注意防护。
2、单个DRG贴壁实验操作难度较大，需仔细耐心。( ）

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