抗体检测也可缩短作用时间。
（四）结合物：在
ELISA中，用酶标记的抗体或抗原统称为结合物，此为进行
ELISA检测的关键试剂。常规使用
ELISA法的主要问题是能够简便地制备酶结合物，而此种制备好的酶结合物要求稳定，具有很高的酶活性，抗原或抗体的特异性，产量高及成本低。
用什么样的酶来标记抗原或抗体呢？可根据以下几点来选择适当的酶。
1、酶制品的纯度及活力高，催化效力也高，放大倍数大（即一个酶分子能催化几十几百个底物分子发生反应的酶）。
2、酶及制备好的酶结合物在检测或贮存中能保持稳定。
3、酶制剂易得、价廉.
4、既要适用于标记抗原，又适用于标记抗体，标记后不影响抗原或抗体的
免疫学特性，也不降低酶的活性。
5、酶的反应产物稳定，检测时简便、快速。在定量测定中产物必须是可溶性的。
6、要有安全、价廉、易得的底物。
符合上述条件的酶有：碱性磷酸酶，一般用分子量为5×10
5（Alkaline Phospatase,简称AP），辣根过氧化物酶（Horse Radish Peroxidase,简称HRP,分子量为4×10
4）,另外尚有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖甙酶，糖化酶及乙酰胆碱酯酶等等。其中以前两种（AP和HRP）最为常用。
AP活力高，制备好的酶结合物可加NaN3防腐，但此种酶不易获得，因其是从小牛肠粘膜中或大肠杆菌中提取，而且价格比较昂贵。因此，目前国内外大多使用HRP。HRP活性也高，价格较便宜。但制得酶结合物不能加NaN3防腐。因NaN3能抑制HRP的活性，但可作低温保存或加60%缓冲甘油等量混合后少量分装，保存冰箱，一般可用1-2年。
由于HRP最为常用，故先把HRP的一般性质介绍一下，以便在制备酶结合物时可引起注意。
(HRP的性质):HRP系从辣根菜的根中所提取，这种酶是无色酶蛋白与暗棕色的铁卟啉（E铁血素）相结合的一种醣蛋白，可简写成由多个（6-7个）同功 酶所组成。分子量约为40000，等电点为PH7.2。能被58-62%饱和硫酸铵沉淀，在PH3.5-12均较稳定。63℃15分钟，室温数周、甲苯和其他苯类有机溶剂处理都不影响它的活性。
由于HRP中的酶蛋白和铁卟啉分别在波长280nm和403nm有二个最大吸收峰，其两者的比值，即O.D
403nm/O.D
280nm称为RZ值（系由德文Reinnoit-Zah）而来，表示酶的纯度。高纯度酶制品RZ值可达3.4。而RZ值0.6的酶其中非酶蛋白含量高达75%。不适合作
ELISA用，经纯化后才能应用。目前我们国产的HRP RZ值达2.5-3.0，亦可作
ELISA用。
抗体：制备酶结合物的抗体最好要提纯。被标记的抗体要求效价及亲和力都要高，因为纯化抗体可增加反应的特异性。如果采用级特异性的酶结合物（例如酶标抗IgM、酶标抗IgG）。有助于区别活动性感染（早期诊断）和已过性感染（追朔诊断）。但在大多数情况下，用抗血清中的全球蛋白成份与酶结合所制成的结合物亦可应用，而且相当稳定。其方法是用硫酸铵沉淀抗血清三次（50%饱和的1次，33%饱和的2次），经透析除盐，即可用于标记。或者经DEAE-纤维素柱层析后所制成的IgG亦可标记。如将IgG再通过葡聚糖凝胶G-200胶滤（用PH7.2 PBS洗脱）所得纯化IgG用HRP标记则更佳。但损失较大，也有人用亲和层析法提纯抗体来标记的。但在用酶来标记抗体前，需测定一下抗体球蛋白效价和蛋白含量。一般用Beutner氏琼脂糖散法测效价（即玻片双相琼脂扩散法），中央孔加1mg/ml抗原，周围孔加不同稀释度粗制或提纯抗体（马或羊抗人IgG），室温扩散24小时，沉淀反应效价达到1：16以上者即可应用。而蛋白质含量可用751紫外线分光光度计测定，也可用Folin酚法测定。
结合：用什么样的方法将HRP与抗体球蛋白结合起来呢？当然不能用强烈的方法，因为强烈的方法会使酶和抗体失去活性。故只能用温和的方法把酶和抗体结合起来。因此，必须使用结合剂。理想的结合剂应具备下列条件：（1）不影响酶及抗体活性，（2）不产生干扰物质，（3）抗体和酶结合后应有较高的产量，（4）不出现非特异性反应,(5)结合程序简便，（6）来源易、价廉。目前常用的有戊二醛和过碘酸钠二种。由于对所使用结合剂的针对性，因此标记的方法也有戊二醛交联法和过碘酸钠氧化法两类。
1、戊二醛交联法：戊二醛是一种能使蛋白质与蛋白质联结最常用的双功能试剂。它有2个对称的活性醛基，可分别与酶蛋白和免疫球蛋白上的游离氨基（酚基、味唑基、巯基）以共价键边接起来而形成的酶结合物。例如酶（Fe-E-NH
2CH
2OH，）通过戊二醛与免疫球蛋白（Ig-NH
2）的交联反应式如下：
用戊二醛标记又可分为一步法和二步法。一步法主要是将酶、抗体球蛋白和戊二醛同时混合而直接制备。此法虽然简单，但因酶蛋白的活性氨基少，免疫球蛋白的活性氨基多，在戊二醛作用下，容易形成免疫球蛋白的聚合物，当然也可形成酶蛋白的聚合物。因而，形成酶标记抗体的比例较少，同时抗体和酶的活性丧失较多，结合物的酶活性较低，但较简便。戊二醛二步法中先用过量的戊二醛与酶作用，使戊二醛上的一个活性醛基先与酶蛋白上的一个氨基结合后，除去过量戊二醛（可通过葡聚糖凝胶G-25过柱或用透析法除去），然后，再加入抗体球蛋白，使之与酶--戊二醛复合物反应，形成酶结合物。而酶结合物的多余醛基可用加入小分子的氨基酸如赖氨酸除去，于稳定酶结合物的特异性。在戊二醛二步法中，酶本身并不产生缩合，因为在第二步酶分子上的一个游离氨基仅与戊二醛上的一个活性醛基联结，而戊二醛上另一个活性醛基则可与第二步加入的抗体球蛋白分子上的氨基结合生成酶结合物，因此，两步法优点是能生成均一的酶结合物，大多可使一个分子酶与一个分子球蛋白作用，抗体和酶的活性损失较少，所得酶结合物活性比一步法高10倍左右。
其方法是将10mg HRP溶于0.2ml含1.25%戊二醛的PH 6.8 0.1mol/L PBS中，置室温18小时，充分透析或经葡聚糖凝胶G-25层析除去多余戊二醛，加
生理
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