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（五）洗涤剂与稀释剂：为了使特异性结合的抗体量尽可能多，包被微量反应板凹孔的抗原应该稍微过量。但在孵育或洗涤过程中，已吸附的抗原可能有部份会从固相载体上被洗涤下来。从而使加入被检血清中的特异性抗体以外的蛋白质很可能会吸附到原来包被抗原凹孔的空白处,增加本底颜色,产生假阳性反应,这是限制ELISA特异性的一个因素.因此不少学者在稀释剂及洗涤剂中加入各种保护性阻剂来抑制非特异性蛋白的竞争性吸附作用。已经证明牛血清白蛋白（BSA）和吐温—20有良好的封阻作用。其加入的量BSA为0.5%～1%；吐温—20为0.05%。（有人曾经比较了四种洗涤剂，结果认为蒸馏水加0.05%吐温-20或0.02 mol/L PBS（PH7.4）加0.05%吐温-20都是良好的）。在一般的洗涤剂和稀释剂中还加有NaN3防腐，但是用HRP制备酶结合物时则不能加NaN3，因NaN3能抑制HRP的活性，需要注意BSA加入洗涤剂或稀释剂中虽可改善ELISA的结果观察，但由于BSA比较昂贵，又不易得到，故也不是非加不可的。有人在洗涤剂中加入0.1%白明胶，2%免血清，有利于加强封阻作用。最近有人报告用PH7.4 0.02 mol/L Tris-Hcl缓冲液中加入0.05%吐温-20作洗涤剂，效果很好，被检血清和酶结合物的稀释剂，可与洗涤剂相同，但不需加0.2‰的KCl。 （六）底物：各种酶都有对底物的特异性，所以使用不同种类的酶要求有不同的底物。一旦酶结合物已经确定（如AP或HRP），那么可供选择底物的范围是很有限的。在这有限底物的范围内如何选择合适的底物呢？应按下列几个条件进行选择。 （1）底物在未被酶催化以前应该是无色的，而经酶催化后有明显的颜色变化，这样可使结果分辨清楚；（2）所显色泽易干洗脱； （3）显色后的产物要求稳定，在作定量测定时所产生的有色物质应该是可溶性的； （4）价廉，易得而且无毒。 因此，对AP酶结合物来讲，一般均用硝基苯磷酸盐，显色后呈桔黄色，色泽稳定，用2 mol/L NaOH终止反应，可用波长403nm测定O.D值。AP催化底物产生颜色的反应如下： 因AP是一种磷酸酯酶,它能催化磷酸酯(硝基苯磷酸盐)水介释放出无机磷酸而显色。 对HRP酶结合物来说，主要通过酶的催化作用使过氧化氢还原。同时使另一个底物氧化产生色变，可供选择的底物有几种，过去都用5-氨基水杨酸，它经酶催化后产生棕色产物便于观察，缺点是容易产生沉淀，用于定量测定时有困难。目前大多数使用邻苯二胺（Ortho-Pheny lene-diamine，简称OPD），稳定、敏感，其降解产物呈桔红色，可溶。用2 mol/L H2SO4或柠檬酸终止反应，可在492nm波长的酶标比色计上测定O.D值，也可目测。HRP在催化反应中可使H2O2分解出新生态氧，本身还原成水，而使OPD氧化生成有色产物，反应式如下： O.P.D对光不稳定，故加后需放暗处作用，但据报告有致突变性，使时需注意。此外尚可选用邻联甲苯胺（Ortho-Toli dine，简称OT），显色以后呈兰色，可用波长630nm测O.D值，不需终止反应。也可用目测，但显色后不稳定，40分钟色泽会自行减退，故需及时测定结果。加终止剂后呈现黄色，则需用波长405nm测定O.D值。 底物配制方法如下： 1、用O.P.D作底物：先配制PH5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。取0.1 mol/L（19.2克/升），柠檬酸溶液24.3ml，加0.2 mol/L（27.4克/升）Na2HPO4溶液25.7ml，再加蒸馏水50ml，然后将40mgO.P.D溶解其中，再加30% H2O2 0.10ml即可应用，用时新鲜配制、避光。 2、用OT作底物，先配PH3.7的醋酸盐缓冲液，取0.2M醋酸（12ml/升）和醋酸钠（16.4克/升）溶液等量混和，然后称取OT 21.2mg先溶于1ml二甲基乙酰胺中，再将OT溶液倾入100ml PH3.7的醋酸盐缓冲液中，并加入30%H2O2 0.05ml即得，用前新鲜配制。 （七）作用时间：加底物后要多长时间终止反应测定结果呢？一般可采取二种方法。 1）任意确定一个时间，如20分钟或30分钟终止反应，测定被检标本和阳性参考标本的O.D值。这样所得的数据要进行校正，校正可按下列公式： 2）制备好一批酶结合物后预试时间，在反应温度固定时，当阳性参考血清O.D值达到1.0时终止反应，记录这个时间，如30分钟，以后用本批酶结合物测定待检样品时都采用同一时间终止反应，这个办法不需要校正，比较方便。 国外在使用自动测定仪时，加底物后随时测定，每块试验板上阳性参考血清的O.D值，当其达到1.0时，立即将全板上被试标本终止反应进行测定，这样所得结果比较一致。我国也有自动酶标测定仪，但由于固相载体不够均匀，也很难用板来直接测定。 在ELISA中所加酶结合物之浓度，加后孵育时间以及加底物后孵育时间。这三个因素也是互相有影响的。一般讲，酶结合物浓度低，则要求孵育时间长些，而酶结合物浓度高则要求孵育时间短些，可根据实验的具体情况，变更不同因素，以取得良好的结果。 由于ELISA中变异因素多，对于要诊断某一疾病时，必须进行一系列实验室预试，摸索，或叫实验研究，在酶结合物已经确定的情况下，一般要求预测以下5个条件： （1）抗原包被浓度； （2）被检血清稀释度，即测剂量反应曲线； （3）第一抗体作用时间； （4）酶结合物作用时间； |
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