（5）底物作用时间。
一旦试验条件摸清，以后在正式测定时，必须固定条件，不要随时改变，以使试验系统保持足够的稳定性。
（八）结果判断:
ELISA的试验结果可用肉眼观察颜色反应的深浅作出判断，也可用分光光度计作精确测定。当然,后者更为正确。而肉眼观察更为简便，而且也有一定正确性。据Adler（1980）报告,目测为±1
、2
、3
、4
相当于分光光度计测定O.D值。
不论用哪种方法判定结果，每次都要有阳性和阴性参考血清作对照，这样可以消除一些外界的影响因素。
≤0.04“±” 0.06～0.092和0.08～0.25“ ”
0.26～0.5“ ” 0.51～1.0“ ” > 1.0“ ”
(九)试验的重复性（精确度），有二种方法来检验试验的精确度：通常用变异系数来表示：1、几个样品用ELISA法同时进行多次测定求出CV%；2、不同时间对不同操作者对某几个样进行多次测定求出变异系数。CV是个体参数标准差与平均数的比率。
S / X ＝ CV ，CV应低10%，不应大于10～15%。
不论目测或分光光度计测定，均可作一个稀释度或一系列稀释度测定，一般常规诊断只用一个稀释度判断阳性或阴性就可以了，这样比较方便，现在推荐传染病的血清诊断用1：200一个稀释度。有些需要精确定量的，可作一系列稀释度测定。
记录结果有下列几种方法：
1、“ ”或“-”：所有超过规定的O.D值（如O.D，0.4）的标本均属阳性，此规定O.D值是根据事先测定大量阴性标本所取得的，此规定值是阴性标本的上限。或者以一组阴性标本O.D平均值加2～3个标准差作为阳性阈值。
2、直接以O.D值来表示，如0.4、0.7、1.2，O.D值越大，阳性反应越强，但此数值是在固定实验条件下得到的结果，而且每次实验都要有参考标本作对照。
3、以终点滴度表示：将标本作连续稀释，最高稀释度能出现阳性反应者（即OD值仍大于阳性阈值，即为该标本的滴度。
4、以“比值”表示：求出被检标本的O.D值与一组阴性标本O.D值的比值，例如为阴性标本的2倍或3倍，即为阳性，比值小于2.1而大于1.5为可疑，<1.5为阴性。
如在此测定时以空白校正“O”点。
5、以“单位”来表示：在测定被检标本的同时，再测定一个含已知单位数的阳性参考血清，用不同稀释度作ELISA检测后，以O.D值为纵坐标，单位数为横坐标，画出标准曲线。以后可根据被检标本的O.D值，从曲线上找出相应的单位数，再乘于血清的稀释倍数，即可得出被检标本的单位数。
作试验时的阴性参考血清最好不要显色，否则会对结果判断带来困难，特别在目测时，当阳性标本O.D值>2.0时，应作适当稀释后再作测定。
（十）对使用仪器要求：所用仪器如吸管、烧杯试管都要清洁，用于酶结合和底物的吸管和容器一定要分开。试剂要求标准化
四、具体操作法
上面已经把ELISA中各步骤的影响因素作了说明，为了便于工作下面把ELISA的操作程序列于表1供参考：
表1：ELISA操作步骤
|
方法
步骤 |
间接法（测抗体） |
双抗体夹心法
（测抗原） |
竞争法（测抗原） |
抑制性测定法 |
|
1 |
包被抗原：用包被缓冲液稀释抗原至最适浓度（5～20μg/ml）各0.3ml加于微反应板每个凹孔中,4℃过夜或37℃水浴2～3小时,贮存冰箱 |
包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度（1～10μg /ml），每凹孔加0.3ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱 |
包被特异性抗体：
同左
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