一、免疫细胞化学技术的概述
¨ 免疫细胞化学(immunocytochemistry, ICC)
– 是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定细胞内抗原的成分(主要是多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为～。
(一) 对抗原和抗体的要求
¨ 具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。
– 对抗体的要求：纯度高、比活性强；
¨ 高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。
– 对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。
(二) 抗原 (antigen, Ag)
¨ 抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质，称为抗原。抗原具有两个方面的特性：
– 免疫原性：引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性；
– 免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。
¨ 根据抗原是否显示免疫原性分为：
– 完全抗原：分子量较大，一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。
• 免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。
– 半抗原：又称为不完全抗原，分子量较小。例如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。
• 半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。
载 体
¨ 通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。
– 常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。
– 用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。结合比例为5kDa结合5～25个分子的小肽。
（三）抗体 (antibody, Ab)
1、抗体的概念：
¨ 机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白，被称为抗体。
– 抗体主要存在于血清内；
– 抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗体。
– 免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、 IgD、IgE、 IgA、IgM。
2、免疫组化实验中常用的抗体：单克隆抗体和多克隆抗体。
¨ 单克隆抗体：是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。
– 特异性强、抗体产量高。
¨ 多克隆抗体：是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
– 特异性低，会产生抗体的交叉反应。
– 多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。
– 抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时，是不能聚合成大颗粒。
3、抗体的制备——多克隆抗体的制备
¨ 动物的选择
¨ 佐剂(adjuvant)
¨ 免疫方法
¨ 免疫剂量
¨ 抗体效价的测定
¨ 放血或定期抽血
(1) 动物的选择
选择什么动物来免疫取决于：
¨ 所需抗血清的量
– 小鼠只能提供1.0～1.5ml的血液，而山羊能提供几升。
¨ 能供免疫用的抗原量
– 小鼠50mg足够，而山羊需要几毫克。
(1) 动物的选择(续)
¨ 动物的品系：免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。
– 例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。
– 常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔(新西兰兔，年轻，健壮，体重在2.5kg左右，雄性)为最常用。
(2) 佐剂 (adjuvant)
¨ 一般可溶性抗原注射后，迅速从注射部位扩散、吸收代谢。佐剂可延长潴留时间，且延长免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程中，常将抗原和佐剂一起注射。
¨ 最常用的佐剂是弗氏佐剂，又分为:
– 弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant)
– 弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant)
弗氏不完全佐剂
(Freund’s incomplete adjuvant, FIA)
¨ 是由油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或Tween80)混合而成，比例为1:1、2:1、3:1或5:1，可根据需要而定，通常2:1。
¨ 使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。
弗氏完全佐剂 (Freund’s complete adjuvant, FCA)
¨ 在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌(终浓度为2～20mg/ml)，即成为FCA。
¨ 免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积 1:1 混合乳化后(油包水)注入动物。
– 一般首次注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。
佐剂与抗原乳化的方法
¨ 研磨法：适于制备大量的佐剂抗原
– 先将不完全佐剂加热，取1.73ml放人无菌玻璃研钵内；缓缓滴入0.23ml活卡介苗，边滴边按同一方向研磨，使菌体完全分散。
– 按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。
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