¨ 缺点：研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。
佐剂与抗原乳化的方法(续)
¨ 注射器混合法
– 将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，然后插入三通管内，交替推动针管混匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。
¨ 优点：无菌操作，节省抗原或佐剂。
¨ 缺点：不易乳化，时间长。
佐剂与抗原乳化的方法(续)
¨ 快速乳化法：利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。
– 将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下 0.5cm，离瓶底0.5cm左右，以免打碎离心管。
– 每次乳化 10～15s，然后置冰箱lmin左右。反复乳化3～4次即可完全乳化。管内残余量800r/min离心5～10min收集。
¨ 优点：简单、快速、节省材料。
乳化剂的鉴定
¨ 判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上(冷水中)，如能长时间保持圆珠形而不散开，表示乳化达到要求。
(3) 免疫方法——免疫途径
¨ 常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。
¨ 一般采用多点注射方法
– 常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。
– 皮内易引起细胞免疫反应，有利于提高抗体的效价。
(3) 免疫方法——免疫途径 (续)
¨ 几点说明：
– 大动物一般不用腹腔注射
– 颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射
– 抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法，只需10～100mg抗原即可获得较好的免疫效果。
– 皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入。
(3) 免疫方法——次数及间隔时间
¨ 次数一般为2～3次(初次免疫和加强免疫)
– 首次注射后，10～15天再加强注射；
– 剂量同首次或为首次的一半，用不全佐剂或不用佐剂。
¨ 间隔时间，一般而言，动物越大，间隔越长
– 豚鼠、大鼠为7～8天，兔子为10～15天，羊为14～28天；
– 第三次注射的间隔时间更长些，效果更好。
举例1：家兔的免疫
¨ 初次免疫
– 用50～200mg Ag加入FCA，在背部皮下注射6～8点，每点0.1～0.2ml，也可肌肉内或皮内注射；
¨ 两周后，加强免疫
– 将50～200mg Ag于PBS或FIA中，在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射；
¨ 抗体效价的检测：加强免疫一周后，耳缘静脉采血
– 抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。前者抗体效价在1:4000以上，后者在1:16以上，即可采血，取血清进一步提纯。
举例2：微量抗原淋巴结内注射免疫家兔
¨ 一般选择2.5～3.0kg的新西兰种公兔
– 先在其两脚垫注射完全福氏佐剂0.2ml(卡介苗每兔合5mg)；
– 10天后，见胭窝淋巴结肿大，然后将抗原注射至肿大的淋巴结内，第一次注射抗原用完全福氏佐剂混合乳化；
– 以后每隔20天用不完全福氏佐剂乳化抗原，以同样方法加强2次，各次注射的抗原均为25～50mg；
– 末次注射两周后兔耳放血测价 (可达1:128)。
举例3：豚鼠和大鼠的免疫
¨ 初次免疫
– 用10～100mg Ag加入FCA，在背部皮内注射4～6点，每点 0.lml，也可肌肉内或皮下注射；
¨ 加强免疫
– 每隔 7～8天，将10～50mg Ag于 PBS或FIA中。在肌肉、皮下或静脉注射；
¨ 抗体效价的检测
(4) 免疫剂量
¨ 抗原性强的抗原量应小，过大反会引起免疫抑制；
¨ 免疫周期长的动物可少量多次注射，短的可大量少次。
(4) 免疫剂量 (续)
¨ 各种动物首次免疫抗原剂量和加强免疫的剂量
(5) 抗体效价的检测
多采免疫双向扩散法
【基本原理】
¨ 指抗原和抗体在同一凝胶内都扩散，彼此相遇后形成特异性的沉淀线。
– 将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内，使两者进行相互扩散，当抗原抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。
¨ 优缺点：简便，但敏感性较低，易出现假阴性结果。
免疫双向扩散法的操作步骤
¨ 将玻璃板用水洗净后用75％乙醇冲洗，晾干后放在水平台上备用。
¨ 将l ％ agar 融化后，置56℃水浴。
¨ 在玻璃板上铺胶，约1.5mm 厚，凝固后打孔(直径 3rnm)，孔间距10mm。
¨ 中心孔加5ml 抗原样品，周围孔内每孔加5ml 抗血清(抗体预先作系列倍比稀释即 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32等比例)。
¨ 凝胶板置湿盒内，室温扩散24h。
¨ 观察结果。
抗体效价检测的其它方法
¨ 环状沉淀试验，需较多的抗血清，现已很少用；
¨ 对流免疫
电泳，比琼脂免疫双扩散法敏感，较简便、实用；
¨ 酶联免疫吸附试验 (
ELISA)。
(6) 放血或定期抽血
常用以下3种方法
¨ 颈动脉放血法：放血量较多，动物不易中途死亡。例如：2.5kg白兔可放血约80ml。家兔、山羊、绵羊等动物采血常用此法。
¨ 心脏采血法：常用于家兔、豚鼠、大白鼠、鸡等小动物，但操作不当易引起动物死亡。
¨ 静脉采血：家兔可用耳缘静脉采血；山羊、绵羊、马和驴可用颈静脉采血，这种放血法可隔日1次，有时可采集多量血液。
(6) 放血或定期抽血 (续)
¨ 采血过程中，动作要轻柔，尽量避免溶血
¨ 血液凝固后，及时离心收集血清，否则细胞溶解释放的杂蛋白(例如蛋白水解酶)将污染抗体并将抗体水解，降低效价；
¨ 加叠氮化钠，分装，低温保存，也可加一定的保护剂如BSA、甘油等。
二、组织和细胞标本的制备
¨ 标本制备恰当，是免疫组化成功的首要条件
¨ 免疫组化对组织和细胞标本的要求
– 保持所检标本原有的结构、形态；
– 在原位最大程度地保持待测抗原(或抗体)的免疫活性，既不淬灭、流失或弥散，也不被隐蔽。
¨ 免疫组化的组织和细胞标本，制作流程与常规处理方法基本相同，但对组织、细胞的处理又有其特殊要求及注意事项。
– 各种抗原由于其含量及特性的差异对标本处理方式常有不同要求，因此要选择适用于本实验的最佳方法。
免疫组化中常用的组织和细胞标本
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