4、载玻片的处理
¨ 抗原修复过程中，由于高温、高压等诸多固素的影响，极易造成脱片。为防止脱片，常用粘附剂处理载玻片。
– 新载玻片上有油污，要用洗液浸泡12～24h，自来水冲洗后再用蒸馏水清洗；用绸布擦干或烤箱烤干。清洁的载玻片再用粘附剂处理。
¨ 常用的粘附剂有：
– APES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）
– Polv-L-Lysine（多聚赖氨酸）
– 铬明胶溶液
APES(3-aminopropyltriethoxysilane)
3-氨丙基三乙氧基硅烷
¨ 现用现配。用纯丙酮或甲醇配制2%APES(v/v);
¨ 将洗净的玻片浸于此液中20～30秒钟；
¨ 取出稍停片刻，再入纯丙酮酮溶液洗去未结合的APES，置通风橱中晾干或60℃烤箱烤干。
Polv-L-Lysine (多聚赖氨酸)
¨ 将清洁玻片浸于100mg/ml(10%w/v)的多聚赖氨酸溶液中(去离子水稀释)，37°C放置30min，然后60℃烤箱烘烤1h或室温过夜干燥。装盒备用。
铬明胶溶液
¨ 试剂：铬明矾(chrome alum) 0.25g
明胶(gelatine) 2.5g
蒸馏水 500ml
¨ 先将铬明矾溶解于40℃少量蒸馏水中，再加入明胶及蒸馏水，可在70 ℃水浴中使明胶溶化，搅拌均匀后，即可使用。如有残渣，可过滤后再用。
¨ 用时稍加溶化，切片浸入2～3min，过夜晾干。
(二) 冰冻切片
¨ 冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接切片。
¨ 在切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程。
– 缩短了制片时间
– 抗原性不受损失
• 对稳定性差的抗原，如淋巴细胞表面抗原尤其适合。
¨ 组织冻结过程中，细胞内、外的水分会形成冰晶，冻结的速度愈慢，冰晶颗粒愈大，可严重影响组织、细胞的形态结构。因此制备冻块时要求低温、速冻。
1、冰冻组织块的常用方法
¨ 液氮中冰冻：组织投入液氮中 (一196℃)中10～20sec；
¨ 干冰中加入丙酮(或异戊烷)，液体立即气化起泡，温度降至一70℃ ，将组织投入，若在干冰丙酮中置一盛有异戊烷的容器，组织投入该容器内结冻则更好；
– 上述组织在速冻时应浸埋于OCT包埋剂或甲基纤维素糊状液内，以保护组织。
– 制成冻块后若需保存，应以铝箔或塑料薄膜封包，贮存于-70 ℃冰箱。
2、切片
¨ 供免疫组化用的冰冻切片同样要求附贴平整，并有连续性。
¨ 载玻片也应清洁无油污，但一般无需涂抹粘附剂；
¨ 切片时，使用恒温冷冻切片机，在箱内温度-25 ℃ 。切片厚度一般为4～8mm。
3、切片后处理
¨ 切好的冰冻切片，室温下自然晾干1～2h后，入4℃丙酮固定10min，待干燥后作免疫组化染色或封存于-20℃。
¨ 冰冻切片由于切片技术要求较高，不易得到连续性很好的切片，其形态结构亦不如石蜡片，且冻块和切片不便于长期贮存，因此冰冻切片的应用受限。
(三) 组织印片
¨ 将洁净载玻片轻压于已暴露病灶的新鲜组织切面，细胞即粘附于玻片，晾干后浸入冷丙酮或醋酸-乙醇固定10min，自然干燥后染片或-20℃保存。
(四)
细胞培养片(细胞爬片)
¨ 贴壁
细胞培养时，置盖片于培养瓶中，使细胞在盖片上生长，达适当密度后取出固定(丙酮-20°C固定10～20min)，再进行免疫染色。
– 盖片的处理方法同载玻片的处理，但泡酸时间2h即可。
– 为了防止细胞脱片，可用多聚赖氨酸处理。
(五) 细胞涂片
¨ 大多数细胞涂片由细胞悬液制成，包括：
– 血液、尿液、脑脊液；
– 体腔积液；
– 组织穿刺吸取，如骨髓、淋巴结或其他实质性组织
– 悬浮培养的细胞或贴壁细胞经消化后形成的悬液。
(五) 细胞涂片 (续)
¨ 细胞涂片的方法：
– 手涂法
• 将细胞浓度调节到106/ml左右，可直接涂于载玻片上，但要均匀、不重叠。
• 图片范围应小于1cm直径，以节约试剂。
– 涂片机涂片法
• 将细胞样品制成2×105～6/ml 细胞悬液，吸取50～100ml (1～2×104～5cells) 加入涂片机内，1000rpm离心2min后细胞就均匀分布于玻片上。
三、免疫组化常用的染色方法
¨ 根据标记物的不同分为
– (一) 免疫荧光法
– (二) 免疫酶标法
– (三) 亲和组织化学法
(一) 免疫荧光法
【原理】
¨ 用于免疫荧光的标记物是小分子的荧光素，可标记抗体或抗原；
¨ 荧光素经某种特定波长的光照射激发后，能发射出一种比激发光波波长更长而且能量较低的荧光，籍此可作定位观察或示踪；
¨ 借助于荧光显微镜进行观察。
1、常用的荧光素
¨ (1) 异硫氰酸荧光素 (Fluorescein Isothiocyanate, FITC)
¨ (2) 四甲基异硫氰酸罗丹明 (Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate, TRITC)
¨ (3) 四乙基罗丹明 (RB200)
¨ (4) 碘化丙啶 (propidium iodide, PI)
(1) 异硫氰酸荧光素(FITC)
¨ 易溶于水和乙醇。
¨ 最大吸收光谱为490～495nm，最大发射光谱为 520～530nm．呈翠绿色荧光，分子量 389.4。
¨ 在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与Ig的自由氨基形成共价键，成为标记的荧光抗体。一个lgG分子上最多能标记15～20个FITC分子。
(2) 四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)
¨ 最大吸收光谱550nm，最大发射光谱620nm，呈红色荧光，分子量为444。
¨ 与蛋白质结合的方式同FITC。
(3) 四乙基罗丹明(RB200)
¨ 不溶于水，易溶于乙醇和丙酮。
¨ 最大吸收光谱为570nm，最大发射光谱为595～600nm，呈橙红色荧光，分子量为580。
¨ RB200在五氯化磷(PCl
5)作用下转变成磺酰氯(SO
2Cl)，在碱性条件下，易与蛋白质的赖氨酸e-氨基反应而标记在蛋白分子上。
(4) 碘化丙啶(PI)
¨ 是常用的
DNA荧光标记探针，可作为FITC的胞核对比染色。
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