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抗原修复[Antigen

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-04-09 　本站论坛

3.抗原修复时有效温度所需持续时间根据各单位的设备条件以及使用的仪器不同，抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间也不一样。例如：真空负压抗原修复法，当达到预定的温度和所需的负压（66.7KPa）后可持续5-10分钟，微波辐射抗原修复法温度不好控制，抗原修复液容易沸腾，如果切片附贴任凭其沸腾持续5-10分钟。如果切片附贴很牢固，为了防止脱片，一发现抗原液已沸腾，即可关掉电源，待温度下降后，又可重开电源。如此反复数次，使之持续10分钟。不过似这种停停开开着的做法效果不如开着的，因为开着的除了热效应以外，还有足量的微波辐射。应用高压抗原修复法，当发现抗原修复液沸腾后，加上压力阀，出现喷气后，可持续时间达2-4分钟。隔水热加热抗原修复法，要特别注意内外液体的温度，内液指抗原修复液，外指浸泡抗原修复液容器的水，应用时用温度计浸入抗原修复液测试，使之保持在有效的温度（92℃↑）范围内。持续时间在40分钟，电炉加热抗原修复法，其持续时间在10分钟以上。由于效果较差，该法目前较少使用。
4.抗原修复液必须遵循自然降温规律，否则效果不好或达不到抗原修复的目的。
抗原修复持续时间过后，取出放于室温中让其慢慢地降温，决不能为了争取时间，强行用冰块或冷水令其降温。这是因为当高温中的抗原蛋白分子链脱离了其它的束缚或联结，要有一个自然环境让其自然放松下来，随着温度的降低，它们会慢慢地恢复原来的形态和构型。如果用冰块和冷水强行令其降温，松开后的蛋白分子肽链突遇降温而固定下来，恢复不了原有的构型，达不到预想的效果。
5.尽量使用足量的抗原修复液。
抗原修复的方法，都采用加热的方法，尤其是微波辐射加热法，该法由于产热快。液体容易挥发直至干涸。因此，应用于抗原修复的液体，一定要充足，防止切片干涸。用于抗原修复的切片，如果由于液体少而导致切片的干涸，则应丢弃切片，因为热干涸的切片中的抗原是没办法补救的，因它是一种不可逆的现象。据实验认为，用于微波辐射抗原修复的液体，量大可多至1000ml。应用大量的抗原修复液时，由于它的量较大，可延缓了液体的沸腾时间，增加了切片受微波辐射的量，对抗原修复将达到彻底。
6.切片必须附贴牢固。
用于抗原修复的切片，必须附贴牢固，否则发生掉片，则前功尽弃。

（2）化学试剂抗原修复法：
1. 胃蛋白酶消化法：
①切片脱蜡至水。
②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。
③自来水洗，蒸馏水洗。
④PBS洗3次，1分钟/次。
⑤滴上配制好或商品化的胃蛋白酶，处理切片20分钟左右。
⑥PBS冲洗3次，2分钟/次。
⑦后按选择好的免疫组化该法进行染色。
2.胰蛋白酶消化法：
①切片脱蜡至水。
②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。
③自来水洗，蒸馏水洗。
④PBS洗3次，1分钟/次。
⑤滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片20分钟左右。
⑥PBS洗3次，2分钟/次。
⑦后按选好的免疫组化染色方法进行染色。
评价：上面介绍了胃蛋白酶和胰蛋白酶两种酶的使用方法，因这两种酶在平常较常被使用，故而专门进行介绍，除此之外，无有几种酶如链霉蛋白酶，无花果蛋白酶菠萝蛋白酶等也可被用来消化切片。其用法基本一样。
　　现今应用酶来消化切片，主要是根据抗体的要求来进行的，否则都应用物理化学试剂抗原修复法来进行。因为酶消化不适合于多数的抗体，效果也没有其它方法好，因此临床上都较好用它。
作好免疫组化染色必须注意的问题
I、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。
在免疫组化最后结果的判断时，常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象，经多方研究认为，它是一种假性非特异性的染色。因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散，肿瘤细胞无限制的生长和生长过速，导致肿瘤中间部分组织血液供给困难，造成缺血坏死，坏死细胞中的抗原由于机体的作用，可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质，这是抗原发生弥散的一种方式。另一种抗原弥散的方式就是，由于组织没有及时的固定所引起的。离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散，这是一非常普通的常识，但要做好却是极不容易。标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间，在这段时间里，有的抗原就可以发生扩散。虽然已浸入了固定液，但标本较大，固定液的量又不足，当然由于固定液的渗透需要时间，当渗入到组织之中时，中间的细胞已发生了变化，抗原也随着发生扩散，这种现象在产酶多的器官是比较明显的，如胃癌，当切除后标本较大，虽然在手术室期间已放入了固定液，但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要几个小时的时间，当固定液发挥作用时，组织已经发生变化。因此，这了达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。
II、组织脱水必须彻底干净
组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。
III、切片必须完整、均匀、平展、无邹折、
应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无邹折，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一，　不平。如果切片有汽泡切片在烘烤时，由于汽泡的破裂影响了汽泡周围的组织，在其周围可观察到深浅不一的染色。如果切片有邹折，免疫组化染色后，在邹折的地方有深浅不一的颜色，这是一种假阳性，容易引走混淆。
IV、切片的附贴必须牢固，必须使用合适的粘贴剂。
免疫组织化学染色前的前期准备工作，就是必须对新的载玻片进行处理，新的载玻片表面看起来很干净，有人认为不需要进行任何的处理，都能够适合使用，这是一种错误的想法。新出厂的载玻片，表面复盖着开一层油脂样的物质，如果不加以处理，对切片的附贴是极为不利的。我们的做法是：新的载玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜，然后取出，经自来水彻底冲洗后，浸入酒精中达2小时以上，取出擦干备用或烘干也可。然后再将载玻片浸入了－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy-silane）的稀释液（1：50用丙酮或无水乙醇稀释都可以）中硅化10分钟，后经无水乙醇洗2次，烘干即可使用。

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