（一） 免疫荧光细胞化学技术
1941年，浣熊等建立了免疫荧光细胞化学技术，它的原理是根据抗原抗体反应的规律，把已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗原或抗体，然后以它作为探针来检测组织或细胞内的相应物质。应用的方法有直接法、间接法、夹心法和补体法等。在荧光显微镜下，根据其形成复合物所发的荧光，来确定判断检测物的来源、性质和部位。目前，免疫荧光细胞化学技术已经广泛地应用于许多研究领域，如免疫学、微生物学、病理学和临床检验学等。
由于免疫荧光细胞化学技术所具有的特异性、快速性和某方面的准确性，又由于许多新技术和仪器的应用如激光技术、电子计算机、扫描电镜和双光子显微镜、荧光激活细胞分类器等，该项技术可发展至更高的阶段，开创更新的领域。虽然如此，应用于临床作为病理学的诊断还是少之又少，相信随着各种技术的提高，在不久的将来，将会有更多的荧光抗体被应用于临床的诊断。
（1）常用的抗体和蛋白质标记的荧光素有：
①异硫氰酸荧光黄（Fluoresein isothiocyanate，FITC）：结晶粉末状，呈黄色、橙黄色或褐黄色，易溶于水和酒精等溶剂，室温下可保存两年以上，最大发射光谱为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。
②四甲基异硫氰酸罗达明（Tetramethylyodamine isothiocyanate，TRITC）：结晶粉末状，呈紫红色，易溶于水和酒精等溶剂。最大发射光谱为620nm，呈现橙红色荧光。
③四乙基罗达明（Tetramethylyodamine B200，RB200）：结晶粉末状，呈褐红色，易溶于酒精和丙酮，但不溶于水。最大发射光谱为596～600nm，呈现橙红色荧光。
（2）常用的荧光标记法
①直接法：这是最早的方法。其基本原理是用已知的抗体标记上荧光素后成为特异性荧光抗体，染色时将该抗体直接滴在载玻片上进行孵育，使之直接与载玻片上的抗原结合，于荧光显微镜下观察检查，作出判断。
评价：该法简单易行、特异性高、快速方便，常用于肾活检几种免疫球蛋白的检测和病原体的检测。但其存在不足就是只能检测相应的一种物质，敏感性较差，效果有时不理想，目前较少作为更多方面的检测。
②间接法：该法的基本原理是用特异性的抗体与切片中的抗原结合后，继用间接荧光抗体，与前面的抗原抗体复合物结合，形成抗原抗体荧光复合物。在荧光显微镜下，根据复合物的发光情况来确定所检测的抗原。
评价：本法由于结合在抗原抗体复合物上的荧光素抗体增多，发出的荧光亮度强，因而其敏感性强。目前本法应用较广泛，只需制备一种种属荧光抗体，即可适用于多种第一抗体的标记显示。
1.存在问题：
2.制作好的切片不能长期保存，影响各种资料的积累。
3.所作出的结论较主观。
有些经固定的石蜡切片不适合等。
（二）免疫酶细胞化学技术
这种技术的基本原理是通过共价键将酶结合在抗体上，制成酶标抗体，在检测时，抗原抗体复合物中带有标记结合上去的酶，其特性可催化底物，在抗原抗体反应的部位上产生不溶性的有色产物，从而可用一般光镜来检测判断，确定组织的来源、种属和部位。
评价：
1.优点：
2.可用光镜检查。
3.切片可长期保存，有利于资料积累。
4.可以会诊，所得结果较为客观。
5.既适用于冰冻切片，也适用于石蜡切片。
技术较为简单，易于普及和推广。
1.存在问题：
2.酶与抗体间的共价结合可损害部分抗体和酶的化学。
3.酶标记抗体分子量较大，对组织的穿透性较缓慢。
4. 抗血清中的非特异性抗体被酶标记后与切片中的抗原结合，常可引起背景的染色，影响阳性物的判断。
敏感性不强，目前已不被使用。
（三）非标记抗体酶法
由于酶标抗体存在许多问题，1974年Strernberger等人建立了非标记抗体酶法，其中最具代表的方法是过氧化物酶法即PAP法。
奶头法的染色原理：应用第二抗体即桥抗体将抗原抗体结合后的复合物与PAP复合物连接起来，形成较大的复合物，利用复合物中HRP（）水解底物而呈色。
PAP由3个过氧化物酶分子和2个抗过氧化物酶分子组成，呈五角形结构，较为稳定。
评价：PAP法自建立起至二十世纪九十年代初期被应用，它在当时来说具有较高的敏感性，有人认为它比酶桥法灵敏度高出20倍左右，有人则认为它的灵敏度与放射免疫法相似。
1.存在问题：
2.第一抗体和第三抗体必须为同种种属动物。如第一抗为小鼠的，则第三抗体就一定要用小鼠的。
3.抗体孵育时间过长。第一抗体的孵育时要求放于4℃冰箱中过夜，时间可达十几小时。长时间的孵育可产生几种不良后果：一是容易产生背景染色；二是影响染色的成功率，常可导致切片脱离载玻片等。
4.复合物分子较大，移动缓慢，对组织的渗透力不强。
5.可产生背景染色，影响阳性结果。
6.整个过程需时过长，约20小时。
阳性物不明显不突出。
（四）亲和组织化学法
由于其它方法存在许多问题，1981年Hsu等创立了美国广播公司法
（抗生素蛋白－维生素H－peroxidase复杂的技术），它的原理是利用卵白素分别连接生物素标记的第二抗体和生物标记的酶，由酶催化底物，生成终产物，于抗原抗体活性部位沉淀下来。卵白素是一种糖蛋白，在鸡蛋白中被发现，分子量为68000，它与生物素有4个连接部位。据认为卵白素和生物素的亲和力要比抗原和抗体的亲和力高出百万倍，因而它们能够牢固地结合，又不影响它们间的生物活性。
评价：美国广播公司法自1981年创立至今已有二十多年的时间，在各种技术高速发展的今天，这种技术能被较长时间的使用，说明它有着极强的生命力和实用性，这是因为它有着以下主要特点：
1.敏感性强，卵白素与生物有4个连接部位，据认为它比PAP法敏感性更高，高出约20-40倍。
2.需时少，节省大量的时间。如PAP法的一抗孵育时间于4℃冰箱中需十几小时以上，而本法一抗孵育时间在1-60分钟以内。
3.背景清晰，阳性物鲜艳易辨。
4. 抗体可被高度稀释，增加标记病例，降低成本。
存在的问题：
1. 需要预先形成复合物，即卵白素和生物素，在加于切片前的30分钟，先将两者混合起来，形成复合物。该复合物为三维结构，在结合了其它物质后，就会使自身体积增大，行动缓慢，活动受限。
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