细胞免疫检测技术

特异性细胞免疫是由T细胞介导的，因此，细胞免疫检测通常是检查T细胞的数量、功能及其产物如细胞因子等，是了解机体细胞免疫状态的重要手段。
一、淋巴细胞的分离
细胞免疫检测首先要从人或动物血液及组织中分离出活的淋巴细胞。分离淋巴细胞的方法有多种，目前常用Ficoll密度梯度离心法直接分离外周血单个核细胞。
分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液是比重1.077±0.001的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F/H)分层液。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
【材料】肝素抗凝人血、淋巴细胞分层液、无Ca² 、Mg² Hanks液、离心管、试管、吸管、毛细管、白细胞计数板。
【方法】
（1）采取新鲜静脉血2ml，加入含0.1ml肝素（50单位）的试管中，加2mlHanks液混匀。
（2）用滴管将稀释过的血液沿管壁缓慢加入2ml细胞分层液的液面上（分层液与稀释血液体积比例为1：2），注意两者不能混合，保持界面清楚，用水平离心机以2000转/分，离心20分钟，离心完，可见红细胞沉降至最下层，上层为血浆，中层为分层液，血浆与分层液的界面有一比较清楚的乳白色淋巴细胞和单核细胞层（见图4-1）。用毛细滴管吸取该层，置含有1滴肝素及5倍以上体积无Ca² 、Mg² Hanks液的试管中，以2000转/分离心10分钟，弃上清液后，以同样试液再洗涤一次。
（3）尽量吸去上清液，将沉于管底的细胞沉积块摇散，加Hanks液至1ml作细胞计数，用Hanks液配成2×106细胞/ml的细胞悬液。

二、E花环形成试验（erythrocytc rosette forming test）
人类T淋巴细胞表面CD2分子是绵羊红细胞（SRBC）受体，也称E受体，在一定条件下，SRBC环绕T细胞与之结合，形成花环状，称E花环（E-rosette），形成此种花环的细胞称E花环形成细胞（简称E-RFC）。
E花环试验可用作人外周T细胞的分离与鉴定。
【材料】淋巴细胞悬液、1%SRBC悬液、灭活之小牛血清、离心管、试管、吸管、载玻片、0.8%戊二醛、瑞氏染液。
【方法】
（1）取上述配好之淋巴细胞悬液0.1ml于洁净小试管中，加入1%SRBC悬液0.1ml。再加入小牛血清0.1ml，混匀，置37℃水浴箱中5分钟，500转/分，离心5分钟，放4℃冰箱2-24小时。
（2）从冰箱中取出试管，留适量上清液，轻轻摇匀，加0.8%戊二醛2滴，轻摇后，置4℃冰箱15分钟，取出，作成涂片，待自然干燥，以瑞氏染液染色。
（3）计数：镜下观察，凡结合三个以上SRBC的T细胞即为E-RFC，计数200个淋巴细胞，求出E-RFC占淋巴细胞总数的百分率。
【结果】
一般认为E-RFC的正常值在60％以上，如少于50％则为低下。如欲分离T细胞，可用密度梯度离心，E-RFC因比重增大而沉于管底，与其他细胞分离；用低渗法裂解花结中的SRBC，即可获得纯化的T细胞。
三、淋巴细胞转化试验（微量全血法 ）
T细胞在体外培养时，当受到非特异性的有丝分裂原（PHA）刺激后可转化为淋巴母细胞，并进行有丝分裂，转化的淋巴母细胞，在形态上出现了幼稚化，光镜下很容易识别，可通过淋巴细胞转化率反映机体T细胞免疫功能。此试验也可用3H-TdR掺入法或MTT法定量检测。

四、细胞因子测定
细胞因子在机体的免疫应答、免疫调节、肿瘤转移等生理和病理过程中起重要作用。检测免疫细胞所分泌的细胞因子可反映细胞的功能状态，亦是临床上探索疾病发病机制、判断预后和考核疗效的指标。检测细胞因子的方法主要有免疫学测定法、生物学活性测定法及分子生物学测定法。
干扰素含量测定（MTT法生物学活性测定）
干扰素(IFN)可分为IFN-α、IFN-β和IFN-γ等几种，它们在机体免疫调节、抗病毒、抗肿瘤中具有重要作用。
　干扰素能刺激某些指示细胞(如人羊膜上皮细胞Wish株、人喉癌细胞株Hep-2、人胚肌皮、肺单层细胞等)产生抗病毒蛋白，从而使细胞免受水疱性口炎病毒(VSV)的攻击，根据待测样品不同稀释度的保护能力，计算出干扰素生物学活性单位。

【材料】 VSV、Wish细胞、MTT、二甲亚砜(DMSO)、10％FCS RPMI1640、培养板、培养瓶、CO2孵箱、超净台、酶标检测仪。

【方法】

表示IFN对活细胞的保护水平

【结果】
　　以保护半数(50％)细胞免受病毒损害的最高干扰素稀释度为1个干扰素活性单位。也可从标准曲线中求得待测样品的IFN活性单位。

【注意事项】
　　1、实验时先加IFN，后加指示细胞，以使细胞均匀分布于培养板底部。
　　2、本法对天然培养上清或重组IFN-α、IFN-β和IFN-γ均可检测其活性单位。