结果评判:
细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。
3 透射电子显微镜观察
结果评判:凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期(pro-apoptosis nuclei)的细胞核内染色质高度盘绕,出现许多称为气穴现象(cavitations)的空泡结构(图2);Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;
细胞凋亡的晚期,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。
二、线粒体膜势能的检测
线粒体在
细胞凋亡的过程中起着枢纽作用,多种
细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡,而线粒体跨膜电位的下降,被认为是
细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件,它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、
DNA断裂)出现之前,一旦线粒体DYmt崩溃,则
细胞凋亡不可逆转。
线粒体跨膜电位的存在,使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、3,3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6(3)]、Tetrechloro- tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可结合到线粒体基质,其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。
方法:将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine 123(1mM)或终浓度为DiOC6(25nM),JC-1(1mM),TMRM(100nM),37°C平衡30min,
流式细胞计检测细胞的荧光强度。
三、
DNA片断化检测
细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质
DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300kbp长的
DNA大片段, 或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶
电泳上表现为梯形
电泳图谱(
DNA ladder)。细胞经处理后,采用常规方法分离提纯
DNA,进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色,在凋亡细胞群中可观察到典型的
DNA ladder。如果细胞量很少,还可在分离提纯
DNA后,用
32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)使
DNA标记,然后进行
电泳和放射自显影,观察凋亡细胞中
DNA ladder的形成。
1. 大分子染色体
DNA片段的测定
细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50~300kbp长的
DNA大片段。所有超过一定分子量大小的双链
DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。线性
DNA的双螺旋半径超过凝胶半径时,即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量的大小来筛分
DNA,
DNA像通过弯管一样,以其一端指向电场一极而通过凝胶,这种迁移模式称之为"爬行"。因此,
细胞凋亡早期产生的50~300kbp长的
DNA大片段不能用普通的琼脂糖凝胶
电泳来分离。通常采用脉冲
电泳技术可圆满地解决这一问题。这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后,大的
DNA分子便滞流在爬行管中,直至新的电场轴向重新定向后,才能继续向前移动。
DNA分子量越大,这种重排所需要的时间就越长。当
DNA分子变换方向的时间小于电脉冲周期时,
DNA就可以按其分子量大小分开。
上一篇:(Direct Immumofluorescent Assay of B-lymphocyte Surface Membrane Immunoglobulin) 下一篇:吞噬细胞吞噬功能检测(Assay
共4页: 上一页 [1] 2 [3] [4] 下一页