2．
DNA Ladder 测定
方法：收获细胞（1X10
7）沉淀?细胞裂解液13000rpm′5min, 收集上清1%SDS和RnaseA（5mg/ml）56°C，2h。蛋白酶K（2.5mg/ml）37°C，2h，1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇沉淀
DNA，4°C过夜。14000rpm′15min最后将沉淀溶解在TE buffer中，加
DNA Loading Buffer 1.2%琼脂糖凝胶
电泳，EB染色并照相。
3． 凋亡细胞
DNA含量的
流式细胞计分析
方法：收集细胞，70%冷乙醇（in PBS）4°C固定过夜，PBS洗涤，1000rpm′10min RNase A（0.5mg/ml）37°C消化30min PI（50mg/ml）染色，室温避光15min，FACScan分析
DNA亚二倍体的形成及细胞周期的变化。
4. ApoAlertTM LM-
PCR Ladder Assay (CLONTECH)
优点：敏感度高，适合于检测少量样本，小部分凋亡细胞。如临床活组织检测。
四、TUNEL法
细胞凋亡中, 染色体
DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3’-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到
DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有
DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应
细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在
细胞凋亡的研究中被广泛采用。
五、Caspase-3活性的检测
Caspase家族在介导
细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致
细胞凋亡。但在
细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。
1 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
方法：收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE
电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭，室温1.5~2h或4°C过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反应1~2h或4°C过夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→HRP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10min/次→ECL显影或NBT/BCIP显色。
2 荧光分光光度计分析
原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。
方法：收获细胞正常或凋亡细胞，PBS洗涤，制备细胞裂解液加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽荧光底物），37°C反应1h，荧光分光光度计（Polarstar）分析荧光强度（激发光波长380nm，发射光波长为430-460nm）。
3
流式细胞术分析
方法：收获细胞正常或凋亡细胞，PBS洗涤，加Ac-DEVD-AMC 37°C反应1h UV
流式细胞计分析caspase-3阳性细胞数和平均荧光强度。
六、Annexin V和PI双染法
在本实验中，已经介绍了将荧光素标记的Annexin-V作为荧光探针，利用
流式细胞仪或荧光显微镜可检测
细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
由于凋亡是二十世纪细胞生物学的重要发现，其在医学生物学中具有非常重要的意义，因此检测
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