单向、双向免疫琼脂扩散和免疫电泳[（Single

可溶性抗原与相应抗体以合适的比例发生特异反应时，在一定温度和电解质存在的条件下，经过一定的时间，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应的抗原可以是多糖、蛋白质、脂类等。
根据抗原与抗体的不同条件及其它因素，沉淀反应可以分为以下三种主要形式。即：环状沉淀反应(ring precipitation reaction)，凝胶中沉淀反应(precipitation reaction in gel)，如单向扩散、双向扩散、对流电泳、免疫电泳以及微生物学实验中的絮状沉淀反应(flocculation precipitation reaction)，如梅毒血清检验中的康氏（Kahn）及克莱氏（Kline）试验以及检测白喉杆菌毒力的体外试验-Elek氏试验，检测毒素或类毒素的絮状沉淀单位测定等。本实验主要介绍凝胶中的沉淀反应。
（一） 单向免疫扩散(Single immunodiffusion)—人群血清IgG正常值测定
一、基本原理
在含有特异抗体的琼脂板中打孔，并在孔中加入定量的抗原，当抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合，即形成白色沉淀环，其直径或面积与抗原浓度呈正相关。同时用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测未知标本的抗原浓度(mg/ml 或U/ml)。
应用这一实验方法可检测正常人群或患者血清中IgG、IgA 及IgM的水平。
二、实验材料
2%离子琼脂或生理盐水琼脂（采用0.9%的生理盐水, 内含0.1% NaN3）。
标准马抗人IgG血清（抗体）（北京生物制品研究所生产）
工作标准参考蛋白（北京生物制品研究所生产）
PBS （pH7.2，0.01M）.
打孔器（孔径3mm）及打孔模板
微量加样器
湿盒（容器内加湿纱布或泡沫塑料）
已制备好的含有1%马抗人IgG抗体的琼脂板
稀释的单人份待检血清标本（浓度分别为1/30、1/40和1/50）
三、实验方法
（一）标准曲线的制备：示教
1．按照玻片的大小，准备制做琼脂板所需要的1%离子琼脂。首先分装其1/2量的2%盐水琼脂，例如，用普通载玻片制做时需1%离子琼脂4ml，在分装2%盐水琼脂时即为2ml。溶化后置56°C~60°C水浴中平衡温度备用。
2．稀释抗体，用pH7.2的PBS稀释标准抗人IgG抗体，终浓度为抗体效价的一倍。例如，血清效价为1/140，原浓血清即应按1/70稀释。并分装试管，其分装量应与2%盐水琼脂量相等。
3．制备琼脂板：将已稀释的抗人IgG抗体于56°C水浴中预热约半分钟，再倾注于已溶化并维持56°C~60°C的2%盐水琼脂管中，用拇指将管口堵紧。翻转试管1-2次，将抗体与琼脂混合均匀（注意：抗体与琼脂混合时切勿产生气泡），即刻倾注于玻片上，待凝固后即可。
4．打孔：将琼脂板置于模板上，在同一直线上用打孔器打孔5个，孔距10mm。
5．稀释不同浓度的标准参考蛋白（工作标准）：应根据制品说明进行稀释，例如：工作标准中免疫球蛋白含量，IgG为100单位/ml，80.4微克/单位，其稀释范围为1/10、1/20、1/40、1/80及1/160。
6．加样：将已稀释的不同浓度的工作标准蛋白依次用微量加样器每孔加入10ul。（注意：每一稀释度均应更换塑料吸头）。
7．将加样的琼脂板放湿盒中，置37°C温箱，24小时后观察结果。
8．用量角规测量并记录沉淀环直径，然后以沉淀环直径为纵座标，以标准参考蛋白量（单位/ml）为横座标，绘制成标准曲线。
（二）人血清中IgG正常值的测定：
1．将已制备好的抗体琼脂板置打孔模板上，每一琼脂板可打孔4个（孔径3mm，孔距10mm）。
2．将单位正常人血清用PBS分别作1/50稀释。
3．用微量加样器分别取1/50稀释的单人份血清标本10µl加入孔中，每份标本应各加两孔。
2．作好标记放湿盒中，置37°C温箱，24小时后观察结果。
四、实验结果
测量各份标本的沉淀环直径并记录结果，然后用标准曲线测出每份标本所含IgG的量（U/ml，），并换算为mg/ml。

统计全实验室实验结果并计算出均值，写出较完整的实验报
单向免疫扩散示意图
五、注意事项
1．在制做标准曲线时，为尽量减少误差，至少应做两份以上标准板。
2. 加样时，吸取每份标本均应更换塑料吸头。
（二） 双向免疫扩散 (Double immunodiffusion)—抗原分析
一、基本原理
双向免疫扩散是指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散,彼此相遇后形成一定类型的特异性沉淀线。沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间比例，而且与其分子大小及扩散速度相关。当抗原、抗体存在多个系统时，可呈现多条沉淀线乃至交叉反应。依据沉淀线的形态、条数、清晰度及位置可了解抗原或抗体的若干性质，如浓度、特异性等。
二、实验材料
1%琼脂（生理盐水配制）管，每管约4ml
载玻片
打孔器及打孔模板
微量加样器及塑料吸头
抗原：0.5µg/ml牛血清白蛋白（BSA）、0.5µg/ml人血清白蛋白（HSA）
抗体：兔抗人血清白蛋白加兔抗牛血清白蛋白
湿盒
三、实验方法
1．将已溶化的1%盐水琼脂管放58°C -60°C水浴箱中平衡温度备用。
2．将载玻片置于水平桌面上，倾注已溶化琼脂3.5-4ml，使成厚度约1.5mm琼脂板（注意：倾注速度不要过快，以免琼脂溢出载玻片；倾注过程要连续以保证琼脂板均匀、平滑）。