| 抗体的提取与纯化 | | 点击： 作者： 来源： 时间： 2007-04-09 本站论坛 |
|  |
5．收集
开始洗脱的同时就以试管进行收集。每管收集3～5ml 。共收集10～15管。
6．测蛋白
以751型紫外分光光度计分别测定每管OD 280nm, 与OD 260nm,按公式计算各管蛋白含量 。并以OD 280nm为纵座标，以试管编号为横座标，绘制洗脱曲线。
7．合并、浓缩
将洗锐峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并，以PEG（MW6000）浓缩至所需体积，加入0.02% NaN3防腐，于4℃保存备用。长期保存时应贮于-40℃冰箱。
8．A-50凝胶的再生
在柱上先以2mol/L NaCl洗脱蛋白至流出液的OD 280nm<0.02，再以蒸馏水洗去柱中盐。然后按预处理过程将A-50再处理一遍即达到再生。近期用时泡于洗脱缓冲液中4℃保存；近期不用时，以无水酒精洗2次， 再置50℃温箱烘干，装瓶内保存。
（二）注意事项
（1）柱的选择：从理论上说，只要柱足够长，就能获得理想的分辨率，但由于层析柱流速同压力梯度有关，柱长增加使流速减慢，峰变宽，分辨率降低。柱的直径增加，使流体流动的不均匀性增加，分辨率明显下降。
（2）纯化过程必须严格控制缓冲液的pH及离子强度 。样品与A-50凝胶必须用洗脱缓冲液彻底平衡后，才能进行柱层析。
（3）所装的柱床必须表面平整，无沟流及气泡，否则应重装。
（4）洗脱过程中应严格控制流速，切勿过快。
（5）上样的体积要小，浓度不宜过高。
（6）加样及整个洗脱过程中，严防柱面变干。
四、SPA-Sepharose CL-4B 亲合层析纯化 IgG及IgG亚类
（一）原理
葡萄球菌A蛋白（SPA）具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力有所差别。改变pH及离子强度可洗脱结合于SPA-Sepharose CL-4B 柱上的IgG或不同的 IgG 亚类，可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。
（二）操作步骤
用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液浸泡SPA-Sepharose CL-4B凝胶，15min。按1g干胶200ml上述缓冲液充分洗涤凝胶，（用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤）。
↓
装柱后用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液平衡。
标本可用硫酸铵粗提物，先10000g离心除去杂质，必要时用0.22μm滤膜过滤，上样前用1mol/L pH9.0 Tris 液调整标本液pH至8.1或对平衡液透析过夜。
↓
加样，一般按25～30mg IgG/g湿胶比例加样，室温作用15min，用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液充分淋洗，到淋洗液OD值为<0.02。
↓
用不同pH的枸橼酸洗脱液洗脱，流速20ml/h。如纯化小鼠IgG1一般用pH6.0;纯IgG2a用pH4.0 ；纯化IgG2b用0.1mol/L pH3.0醋酸盐缓冲液0.1mol/L pH3.0glycine-HCl缓冲液洗脱。
↓
用pH3.0或4.0洗脱液洗脱时，用适量固体Tris直接中和含有IgG的洗脱液。
↓
收集洗脱液测OD值，根据实验需要透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定。
（三）试剂器材
（1）SPA-Sepharose CL-4B （pharmacia）
（2）磷酸缓冲液0.1mol/L pH8.0 0.02% NaN3
（3）枸橼酸缓冲液
0.1mol/LpH6.0
0.1mol/LpH4.0 0.02% NaN3
0.1mol/LpH3.0
（4）1mol/L pH9.0 Tris溶液
（5）再生缓冲液：①0.1mol/L Tris含0.5mol/L NaCl调整pH至8.5 0.02% NaN3 ;②0.1mol/L 醋酸钠含0.5mol/L NaCl调整pH至4.5 0.02%NaN3。
（四）注意事项
（1）SPA-Sepharose CL-4B凝胶价格昂贵，可再生后反复使用10～20次左右。方法：
先用10倍柱体积0.1mol/L pH8.5 Tris含0.5mol/L NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；再用10倍柱体积0.1mol/L pH4.5醋酸钠缓冲液含0.5mol/L NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液平衡，4℃贮存。
(2)SPA-Sepharose CL-4B亲 合层析法还可用于：①除去抗体液中IgG,检测非IgG抗体（如IgM）的生物学活性；②除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段；③吸收或纯化免疫复合物。
（3）狗、猫的多克隆IgM和IgA以及单克隆IgA和IgM也具有与SPA结合的能力。
五、高效和液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体
从小鼠腹水中纯化McAb的方法有盐析、离子交换层析、凝胶过滤和亲合层析等。应用TSK DEAE-SPW离子交换层析柱从小鼠腹水中纯化McAb不仅纯化速度快，回收率和得率高 ，而且保持良好的生物学活性。
（一）原理
根据离子交换原理，将经硫酸铵粗提的含McAbγ球蛋白上样结合于层析柱上，通过增加洗 脱液中的离子强度，洗脱并收集蛋白峰。
（二）操作步骤
腹水离心10000 g,10min，除去细胞和杂质，在4℃下逐滴加入饱和硫酸铵溶液，使终浓度为40%饱和硫酸铵
↓搅拌20～30min
离心，沉淀用40%饱和硫酸铵洗涤2次后溶于PBS，对缓冲液A（pH8.5, 20mmol/L Tris缓冲液）透析除盐
↓4℃过夜
用带有1000μl样品环的高压加样活门将透析后粗提物加样于经缓冲液A液平衡的TSK DEAE SPW离子交换层析柱
↓
洗脱流速1ml/min
0～1min ：0→5%缓冲液B（20nmol/L Tris, Ph 8.5,含2.0 mol/L醋酸钠）
1～2 min( 线性梯度洗脱)：5→20%缓冲液B
20～22min：20→0%缓冲液B
↓
洗脱液用紫外280nm进行监测
↓
收集蛋白峰，进行含量、纯度和活性测定
（三）试剂和器材
（1）TSK DEAE SPW离子交换层析柱 （75mm×7.5mm,Bio Rad）
（2）高效液相色谱仪（包括控制系统、溶剂传递系统、高压加压活门和紫外280nm监测系统）
（3）PBS，缓冲液A和B。
（四）注意事项
（1）所用缓冲液和加样粗提物均需0.2μm滤膜过滤。
（2）在本实验条件下，IgG1峰一般在线性梯度洗脱开始11-12min。但不同类和亚类抗体以及不同特异性McAb 的存留时间（retention time）有所差异。
上一篇：免疫组化非特异性染色的消除方法 下一篇：荧光显微镜检查法
共3页: 上一页 [1] 2 [3] 下一页 | | |
|
|
|
