抗体的制备原理与方法
点击：   作者：   来源：  时间： 2007-04-09 　本站论坛
	6-巯鸟嘌呤	r2b 　K
210.RCY3.Ag1.2.3	LOU大鼠骨髓瘤R210	8-氮鸟嘌呤	－　 K
GM15006TG-A12	人骨髓瘤GM1500	6-巯鸟嘌呤	r1 　K
U-266AR	人骨髓瘤U-266	8-氮鸟嘌呤	ε　　λ

骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10%～20%，细胞浓度以104～5×105/ml为宜，最大浓度不得超过106/ml。当细胞处于对数生长的中期时，可按1：3～1：10的比例传代。每3～5天传代一次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8-氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。
　　（2）饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备McAb的过程中，许多环节　需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为2×104或105细胞/孔。
　　2．细胞融合的步骤
　　（1）制备饲养细胞层：一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。
　　与免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周
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　　拉颈 处死，浸泡在75%酒精内，3～5min
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　　用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜
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　　用无菌注射器注入5～6ml预冷的培养液（严禁刺破肠管）
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　　反复冲洗，吸出冲洗液
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　　冲洗液放入10ml离心管，1200rpm/分离5～6min
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　　用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数至1×105/ml
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　　加入96孔板，100μl/孔
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　　放入37。c CO2孵箱培养
　　（2）制备免疫脾细胞
　　最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死
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　　无菌取脾脏，培养液洗 一次
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　　脾脏研碎，过不锈钢筛网
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　　离心，细胞用培养液洗2次
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　　计数
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　　取108脾淋巴细胞悬液备用
　　（3）制备骨髓瘤细胞
　　取对数生长骨髓瘤细胞离心
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　　用无血清培养液洗2次
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　　计数，取得×107细胞备用
　　（4）融合
　　①将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200rpm,8min;弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（PEG）浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。
　　②90s内加入37℃预温的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。
　　③加37。C预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。
　　④离心，800rpm, 6min。
　　⑤充上清，用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。
　　⑥将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。
　　⑦将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。
　　（三）选择杂交瘤细胞及抗体检测
　　1．HAT选择杂交瘤细胞 　　　脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。