| 辛酸/硫酸铵法提纯IgG | | 点击： 作者： 来源： 时间： 2007-11-13 本站论坛 |
|  | 原理
在酸性条件下 ( pH4. 5)，非1gG的蛋白成份(包括白蛋白，部分Ig)，能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG.。辛酸/硫酸铵法比硫酸铵法能够获得更高纯度的IgG。
材料与方法
材料
动物腹水
辛酸(caprylic acid, CA)，化学纯
硫酸钱，分析纯
SPA Sepharose 4FF亲合层析柱
操作方法
1. 蛋白含量测定
紫外分光光度法测样品在波长260nm, 280nm处的I及收光度(A 260, A 280) ,蛋白含量按以下公式计算：
蛋白量（g/L）=(1. 45* A 280- 0. 74* A 260) *稀释倍数
2. 主要步骤
（1） 腹水滤纸过滤去沉淀和脂质，滤液用4倍体积60mmo1/ L醋酸缓冲液(pH4. 0)稀释后，用N a0H调，}H值至4. 5;
（2） 逐滴加入辛酸(终浓度25u1/ ml) ,室温h搅拌30分钟后，以6000- 8000 r/ min.离心30分钟，收集上清液;
（3） 上清液经滤纸过滤2次，将滤液与10*PBS(0. lmol/L, pH7. 4)按10: 1比例混合，调pH至7. 4,置冰浴冷至40C ;
（4） 每毫升上述混合液加0.2778固体硫酸钱，40C搅}'}` 30分钟，以4000- 6000r/ min离心巧一20分钟，将沉淀溶于少量YBS，透析，测蛋白含量，冻存。
3. 硫酸铵沉淀法
按常规方法将腹水分别经50% , 33%饱和度硫酸铵沉淀。
4. 亲合层析
取提取的样品，用0.01lmol/ L Na2HPO4 (pH7. 4)透析，洗脱使样品中IgG结合于层析柱上，再用0. lmol/ L柠檬酸(pH4. 0)洗脱，收集洗脱液即获纯化IgG。
5. SDS—PAGE电泳鉴定抗体纯度
6. 间接ELISA法测定抗体效价
用sIgA包被酶标板，按常规方法测抗体效价。处理细胞，包被酶标板，测定抗体效价。
7. 得率和回收率的计算
每毫升原腹水中提取的抗体量即为得率(Y field, g/ L );提取所得抗体量与原腹水中抗体量之百分比即为回收率(Recovery,%)。
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