| 单克隆抗体制备方法 | | 点击： 作者： 来源： 时间： 2007-11-14 本站论坛 |
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1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。
采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。
主要仪器设备：
超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，一般的单克隆抗体制备方法大同小异。
方法：
动物的选择与免疫
1. 动物的选择
纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2. 免疫方案
选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫 抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）
↓3周后
第二次免疫 剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）
↓3周后
第三次免疫 剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）
↓2～3周
加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）
↓3天后
取脾融合
目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。
（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。
初次免疫 1×107/0.5ml ip
↓2～3周后
第二次免疫 1×107/0.5ml ip
↓3周后
加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv
↓
取脾融合
细胞融合
细胞融合前准备
1. 骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用的骨髓瘤细胞系见下表。
用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系
名
称
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来
源
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耐
受
药
物
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Ig链
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H L
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P3/X63-Ag8(X63)
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BALB/C骨髓瘤MOPC-21
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8-氮鸟嘌呤
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r1 K
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P3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653)
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P3/X63-Ag8
|
8-氮鸟嘌呤
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－
－
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P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1)
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P3/X63-Ag8
|
8-氮鸟嘌呤
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－ K（不分泌型）
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P3/X63-Ag8.Ul(P3Ul)
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（X63×BALB/C脾细胞）杂交瘤
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8-氮鸟嘌呤
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－
－
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SP2/0-Ag14(SP2/0)
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（X63×BALB/C脾细胞）杂交瘤
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8-氮鸟嘌呤
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－
－
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F0
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BALB/C骨髓瘤
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8-氮鸟嘌呤
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－
－
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S194/5.XXO.BU.1
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P3/X63-Ag8
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5-溴脱氧尿嘧啶核苷
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－
－
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MPC11-45.6TG1.7
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BALB/C骨髓瘤MPC-11
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6-巯鸟嘌呤
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r2b K
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210.RCY3.Ag1.2.3
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LOU大鼠骨髓瘤R210
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8-氮鸟嘌呤
|
－ K
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GM15006TG-A12
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人骨髓瘤GM1500
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6-巯鸟嘌呤
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r1 K
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U-266AR
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人骨髓瘤U-266
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8-氮鸟嘌呤
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ε λ
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