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免疫荧光实验方法及分类

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-11-14 　本站论坛

   抗补体染色法具有和间接法相同的优点，此外，还有其独特的优点：即只需要一种标记抗补体抗体，便能检测各种抗原-抗体系统。因为补体的作用没有特异性，它可以与任何哺乳动物的抗原-抗体系统发生反应。它的缺点是参与反应的成分多，染色程序较复杂，比较麻烦。
   除上述三种方法外，还有在此基础上演变出的一些方法，如双层法、夹心法、混合法、三层法、抗体-抗补体法等等。
（3）荧光抗体的制备
   1）免疫血清的制备及免疫球蛋白的提纯　
   制备高效价的特异性抗血清是免疫荧光技术成功的前提。为此，用于免疫的抗原必须高度提纯，尽可能不含其他非特异性的抗抗原物质，血清的效价与特异性是矛盾的，通常以高效价的免疫血清为好，因为用这种血清制备荧光抗体，即使其中含有少量非特异抗体，也可以通过稀释法将其除去。为提高血清效价，在制备免疫原时，通常采用大剂量加佐剂，长程免疫，其中以弗氏不完全佐剂最常用。即按抗原1份，无水羊毛脂1份，液体石蜡2份混合，待充分乳化后，免疫动物，即可能获得高效价的免疫血清。用于荧光素标记的免疫血清，需提纯后使用，这样不但可以提高抗体的效价，而且还可以排除γ球蛋白以外的蛋白质，减少非特异性荧光的出现。从免疫血清中将特异性抗体提纯于荧光素标记是免疫荧光技术的关键一环。在免疫荧光技术中所应用的特异性抗体，主要是IgG类，其提纯方法很多，但以饱和硫酸铵盐析法比较简便，也可用分子筛层析法（即葡聚糖凝胶过滤），以及离子交换层析法等，或先用盐析法精提，然后再经过层析柱进一步纯化。
（4）镜检标本片的制备
   荧光抗体染色是显微镜标本上的抗原—抗体反应。采集病料以后，必须制成镜检标本。作为检测抗原目的标本片，细菌检样如血液、脓汁、粪便、分泌物等可进行涂片；病毒检样可将组织进行冰冻切片或石蜡封片，或将病毒材料接种细胞进行培养，作成单层盖片。如为检测抗体的标本片，可直接作标准菌株涂片或用标准毒株接种细胞培养，作成单层盖片。
   1）制片
   涂片和压印片是诊断工作中最常用的方法。涂片方法按常规进行。压印片是将被检组织块切开，用滤纸吸干切面的血液之后，以载玻片在切面上轻压，使之粘上1—2层细胞。
   (1)冰冻切片：
   将感染的动物组织切成约3mm2 的小块，置冷台上，以6％明胶液作支持物，迅速冷冻至-15℃——-20℃后压片。切片厚4--8μm，用载玻片贴片，丙酮固定，准备染色。
   (2)石蜡切片：
   将病理组织切成3mm2 的小块，浸入95％酒精1h，再分别通过无水酒精4缸各10min，通过二甲苯3缸各10min，通过56—58度融蜡包埋各16min随后制片，漂浮于40度水中，立即用载玻片捞出（不超过1min）。室温或37度干燥后，通过二甲苯3缸各3min，顺序通过95％、80％、60％、40％酒精各1min去二甲苯，再以PH值7.4PBS蘸浸3次各3min，干燥后染色。
   (3)组织培养单层细胞：
   将盖玻片切成宽4—5mm的小玻片，装入小培养瓶内，按常规方法培养接种病毒的敏感细胞。待细胞在玻片上长成单层后，即可接种病料，经不同时间后（随病毒种类而异），取出被感染的细胞玻片，在PBS液中涮洗，干燥，置丙酮中固定后，准备染色。
   2）荧光色素的标记　
   能够产生明显荧光并能作为染料使用的有机化合物称为荧光色素或荧光染料。用于标记抗体的荧光色素，必须具有化学上的活性基因，能与蛋白质稳定结合，且不影响标记抗体的生物活性及抗原抗体的特异性结合。适于标记蛋白的荧光色素主要有异硫氰酸荧光黄（fluorescein isothiocyanate，FITC），四乙基罗达明（rho-damine B200，RB200）和四甲基异硫氰基罗达明(tetramethyl rhodamine isotheynate，TMRITC)。实际上目前应用最多的只有异硫氰酸荧光黄一种。
   (1)FITC标记　
   FITC为黄色结晶形粉末，分子量为389，易溶于水和酒精等溶剂中，溶解后呈黄绿色荧光，最大吸收光谱为490-495nm，FITC的溶液不稳定，易因水解或迭聚而变质，故需在配好后2h内应用。
FITC含有异硫氰基，在碱性条件下能与IgG的自由氨基（主要是赖氨酸的ε-氨基）结合，形成荧光抗体结合物。一个分子的IgG有86个赖氨酸残基，但一般最多只能标记15-20个。
   ① 直接标记法　
   取抗体球蛋白溶液10ml，碳酸盐缓冲液3ml，生理盐水17ml，混合，在4℃电磁搅拌下加FITC3mg（先溶解在3ml缓冲液中），在4℃继续搅拌4-6h，将结合物通过已平衡好的Sephadex G25柱，以除去未结合的游离荧光素。
   ② 透析标记法　
   将抗体球蛋白溶液用碳酸盐缓冲液（0.25mol/L，pH9.0调动1% (W/V )，并装入透析袋中，按蛋白质量的1/20称取FITC溶于10倍抗体溶液量的碳酸盐缓冲液中，将透析袋浸没于FITC液中，于4℃搅拌16-18h取出透析袋于0.01mol/L，pH7.2PBS中透析4h，将结合物通过已平衡好的Sephadex G25柱，去除游离荧光素。
   (2)RB200标记　
   本品为无定形褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存，分子量为580，最大吸收光谱为570nm，呈明亮的橙色荧光，因与FITC的黄绿色有明显区别，故被广泛用于对比染色或用于两种不同颜色的荧光抗体的双重染色。方法为：取1g RB200及五氯化磷（PCL5）2g放乳钵中研磨5min（在毒气操作橱中），加 10ml无水丙酮，放置5min，随时搅拌，过滤，用所得溶液进行结合。将每亳升血清用1ml生理盐水及1ml碳酸盐缓冲液（0.5mol/L，pH9.5）稀释，逐滴加入0.1ml RB200溶液，随加随搅拌，在0-4℃继续搅拌 12-18h。
   (3)TMRITC标记　
   TMRITC为紫红色粉末，性能比较稳定，分子量为443，最大吸收光谱为550nm，呈橙红色荧光。其结合方法与FITC的直接标记法相同，只是所加色素量为蛋白质量的1/30-1/40，结合时间持续16-18h。

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