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免疫荧光实验方法及分类

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-11-14 　本站论坛

   (4)影响标记的主要因素　
   温度、时间、酸碱度和标记量4个因素。温度低，标记时间长，温度高，标记时间应短。FITC0-4℃以6-12h为宜，20-25℃以1-2h为宜，37℃30-45min为宜。pH低时，标记较慢，pH值偏高（大于10），抗体易变性，pH值9.0-9.5最为适宜。抗体蛋白含量低，标记慢，以每毫升含20-25mg蛋白为宜。至于标记方法，各有特点，但均不能去除非特异荧光染色因素。透析法适用于小体积的标记。
   3）标记抗体的纯化　
   抗体标记以后，应立即进行纯化处理，以消除或降低非特异性染色和特异交叉染色。其步骤如下：
   标记抗体溶液
   ↓透析或凝胶过滤
   去除游离荧光色素
   （粗制荧光抗体）
   ↓DEAE-纤维素层析
   去除过度标记的蛋白分子
   （精制荧光抗体）
   ↓抗原交叉吸收或组织制剂吸收
   去除特异交叉反应的标记杭体
   （免疫纯荧光抗体）
   根据免疫荧光试剂的具体用途，纯化的方法可以不同，并不是每一种荧光试剂都须经过以上全部过程。对于某些细菌诊断试剂，只要除去游离荧光素就可以，检测病毒抗原的荧光抗体一般要求下述处理：
   (1)游离荧光素的去除　
   去除标记过程中未与蛋白质结合的游离荧光素，是纯化标记试剂的最基本要求，不经过这一步处理，任何免疫荧光试剂都不能应用。
   ① 半透膜透析法　
   利用荧光色素分子可以通过半透膜，而蛋白分子则因分子量大不能通过的原理，逐步将游离色素除去。先将标记好的抗体溶液装于透析袋或玻璃纸袋内，注意使液面上留有一定空间，扎紧袋口，先用流动自来水透析5 min，再转入PBS ( 0.01mol/L，pH7.2)或生理盐水中继续透析，外液量至少大于内液量100倍，透析应在低温（0-4℃）下进行，每天换液3-4次，整个透析时间约需1周左右，时间过长容易造成蛋白质变性，影响荧光抗体的质量。取透析液（外液）以紫外线灯检查，若无荧光出现，即可停止透析。
   ② 凝胶过滤法　
   利用荧光色素分子和蛋白质分子量的悬殊差别，通过分子筛除去游离荧光素，一般1h以内即能完成操作，但最好与透析法结合进行。先将标记抗体溶液透析4 h，除去大部分游离荧光素和其他小分子物质以后，再进行凝胶过滤，这样有利于保护凝胶柱，延长使用时间。凝胶柱sephadex G25和G50装好后，以洗脱液（0.001mol/L或0.005mol/L PBS，pH7.0-7.2）平衡，然后加入样品，样品与柱床容积的比例1:2以下皆可。样品全部进入柱床后，即可进行洗脱。应用此法可使游离荧光素完全除去，同时荧光抗体可以100%回收。
   (2)过度标记的蛋白分子的去除　
   去除游离荧光素后，结合物中存在的未标记的和过度标记的蛋白质，是降低染色效价和出现非特异性染色的主要因素。常用的方法是DEAE-纤维素或DEAD-葡聚糖凝胶层析，结合物通过层析柱后，过度标记的部分（易出现非特异性）被吸附，过低标记的或未标记的部分（易降低敏感性）自由流出，从而可以得到荧光素与蛋白质结合比最适的部分。
   DEAD-纤维柱用PBS平衡后，柱上端放一大小合适的滤纸片，打开下口，调解流速至每分钟10-20滴左右，待柱上液面剩一薄层PBS时，用吸管滴加标记样品，样品进入柱床尚离一薄层时，用适量PBS冲洗管壁，然后用大量0.01mol/L，pH7.2PBS洗脱，用20%磺基水杨酸液试测洗脱液。待蛋白出现阳性反应时即可收集，蛋白反应阴转时停止收集，该洗脱液即为纯化的标记抗体。
   (3)特异交叉或额外应用性标记抗体的去除　
   去除特异交叉或额外应用标记抗体，常用组织粉末吸收法，最常用的是肝粉，这一步处理对标记的抗体来说，损失是很大的，一般可省去这一步。
   4）标记抗体的鉴定　
   经过以上各种程序所获得的精制荧光抗体，使用前须做特异性测定、敏感性鉴定以及纯度测定后，才可正式用于荧光抗体染色。
（4）荧光抗体染色
   1)标本的固定　
   在荧光抗体试验中，染色标本的固定是个很重要的步聚。通过固定，不仅要使标记的抗体易于接近抗原，从而发生反应，而且要求标本中的抗原的活性不受损失，同时还要保护其自然形态和位置。因此，根据所研究的抗原和组织细胞种类的不同，相应地采用不同的固定方法。应用最广泛的固定液是丙酮和乙醇，其次是甲醇、甲醛、丙烯醛等。切片标本大多用乙醇固定，组织培养标本主要用丙酮固定。固定液的浓度：丙酮为100%，乙醇为100%或95%，甲醛为10%，甲醇为100% 。固定的温度和时间变化很大，温度从-70℃至37℃都有应用，时间一般在10-30min。
   2)染色
   (1)直接染色法
   可用于传染性法氏囊病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性支气管炎病毒、沙门氏菌等禽病病原的检测。
   ① 于标本片上滴加适当稀释的荧光抗体，置湿盒内，37℃感作30min后取出。
   ② 先以pH7.2PBS冲洗，继以自来水冲洗5min左右，最后以蒸馏水冲洗，自然干燥或吹干。
   ③ 滴加缓冲甘油封片（无荧光甘油9份，pH7.2PBS 1份）镜检。
   ④ 对照的设立
   应用直接法作首次染色试验时必须设置以下对照，随后试验时可酌情减少
   标本自发荧光对照：已知抗原标本加1-2滴PBS或不加，应无荧光出现。

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