| 细胞因子检测方法分类 | 点击： 作者： 来源： 时间： 2007-11-14 本站论坛
|
|  | （1） 分子生物学测定法
这种方法是测定细胞因子mRNA的表达水平。由于细胞因子mRNA半衰期短和拷贝数少，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法，因其灵敏性高和操作简便，比Northern印迹法和原位杂交法更有临床应用前景。
RT-PCR法的扩增技术日臻成熟，目前的主要问题是如何防止假阳性和如何方便定量。假阳性困扰所有PCR操作，这个问题的克服有赖于对操作环境和操作规程的规范及严格限制，有赖于简化及合并操作流程，提倡单管中密闭操作，测定荧光强度代替电泳图像定量法。PCR的定量首先要解决标准化的对照模板，对照模板在逆转录和扩增上与细胞因子的天然模板相同，但扩增产物有所差异，定量时容易鉴别区分。国外一些实验室和公司已制备出若干细胞因子的竞争性mRNA模板，这种模板两端具有与欲测细胞因子引物互补的序列，而模板的中间部分比该细胞因子正常mRNA略短或略长。随着PCR技术的发展和完善，随着细胞因子引物和对照模板的标准化，细胞因子的分子生物学测定方法将会用于临床。
（2） 生物活性检测法
这种方法是检测细胞因子的生物学活性，特异的生物活性和免疫化学特性，是鉴别细胞因子的重要指标；并且，独特的生物活性往往是细胞因子被发现的先导。当然，鉴于细胞因子活性有普遍的重叠性，以生物活性命名造成混乱，现在生物活性在细胞因子的认定上，已降为次要指标，一种新细胞因子的鉴定主要依据其有独特基因结构。尽管如此，由于生物活性测定法提供的是生物功能信息，故本法依然是一种基本的和必需的测定法。
本法是基于测定细胞因子的生物活性，诸如其刺激细胞增殖活性、其维持细胞生长和存活活性、其抑制细胞生长活性、其溶解或杀灭细胞活性、其抗病毒活性、其促进细胞趋化活性、其刺激细胞生成集落活性等等。生物活性的指示细胞多选用造血系统或淋巴系统细胞，显示细胞反应最多的是，用3H-胸腺嘧啶核苷参入，或用四唑盐转化引致的颜色反应。指示细胞可为原代细胞，最好用细胞株，尤其依赖性细胞株细胞。原代细胞不均一，尤其当用人的原代细胞时难免个体差异，数人混合可减少这种影响。细胞因子依赖细胞株细胞的生长和增殖敏感性主要依赖于某一种细胞因子，而对其他细胞因子不反应或反应性极低。细胞因子依赖细胞株的选择和使用可参照文献进行。依赖性细胞株细胞不仅均一，而且在特异性灵敏性方面也明显优于原代细胞和非依赖株细胞。但依赖株细胞的特异性并非绝对，特异性差就成为生物活性测定法普遍的缺点。
细胞因子的受体亲和性高，细胞因子浓度10-10～10-15 mol/L时就可显示生物作用，所以其测定的灵敏度高，一般在免疫化学测定法之上。测定范围在10～100倍，信号与噪音比≥5。生物活性测定法测定的是有生物活性的细胞因子，前体分子、降解片断、与结合蛋白或可溶性受体结合的细胞因子、细胞因子聚合物均不能用此法测定；细胞因子受体拮抗物、细胞因子的天然抗体和一些病毒编码的类细胞因子，也能干扰测定。检验样品中是否有干扰，可将被测样品稀释，作样品剂量-反应曲线，看其是否与细胞因子标准品的剂量-反应曲线平行。
生物活性测定法的缺点是，除需维持靶细胞株，操作繁杂和难定量外，特异性差是最主要缺点。生物学检测法一般敏感性较高，直接表示待测标本中的活性水平。但实验周期较长，如集落形成法需10～14；易受细胞培养中某些因素的影响，如血清、pH、药物；易受生物学活性相同或相近的其它细胞因子的影响，如检测IL-2时可受IL-4的干扰，TNF-α和TNF-β（淋巴毒素）表现出极为相似的生物学作用；易受待栓样品中某些细胞因子抑制物的干扰，如IL-1活性可被IL-1受体拮抗物（IL-1ra）所抑制，TNF-α可被TNF-BP所阻断；不能区分某些细胞因子的型和亚型，如IFN-α、β和γ，以及IFN-α中不同的亚型显示相同的生物学活性；某些指示细胞长期培养易发生突变；不同指示细胞对同一种细胞因子的敏感性不同，所慕名而来结果难于标准化；此外，某些人源的细胞因子如hIL-2对小鼠细胞起作用，但鼠源性的IL-2对人的细胞则无刺激作用。除依赖细胞株的原因外，由于细胞因子受体有共有链，也引起细胞因子活性有交叉性，如白细胞介素（IL）-1和肿瘤坏死因子（TNF）-α；IL-4与IL-5和IL-7，IL-3与粒细胞单核细胞-集落刺激因子（GM-CSF）等。降低这种干扰的方法是，在测定样品中加入抗干扰性细胞因子的中和抗体，中和起干扰的细胞因子活性。
生物活性测定法大致可分为增殖或增殖抑制、集落形成、直接杀伤靶细胞、保护靶细胞免受病毒攻击、趋化作用以及抗体形成法等几类。
1） 增殖或增殖抑制法
其基本原理是应用某一细胞因子能特异地刺激或抑制某些指示细胞的增殖，通过3H-TbR掺入或MTT法显色，反映待检细胞因子的活性水平。
2） 集落形成法
其基本原理是应用骨髓干细胞体外半固体培养系统，根据不同造血因子能诱导干细胞或定向造血祖细胞形成某一种或某些种类细胞的集落，通过对形成集落形态学、酶学鉴定，计算不同种类集落形成的数量和比例，反映待测标本中CSF的种类和活性水平。
3） 直接杀伤靶细胞
在细胞因子中TNF-α、TNF-β具有直接杀伤某些肿瘤细胞的作用，采用TNF敏感的细胞株如小鼠成纤维细胞株L929，以及WEHI164亚克隆13作为指示细胞，通过3H-TdR释放法或染料染色等可检测待检样品中TNF的活性水平。
4） 保护靶细胞免受病毒的攻击
靶细胞受某些病毒感染后可发生明显病变和死亡，干扰素可保护靶细胞免受病毒的攻击，常用的病毒是水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus,VSV）,敏感的指示细胞为喉癌的上皮细胞株Hep2和羊膜的上皮细胞WISH，通过干扰素（IFN-α、IFN-β、IFN-γ）抑制病毒致病变的程度，计算出待测样品中IFN的活性单位。
5） 趋化作用
IL-8对多形核细胞、淋巴细胞具有趋化作用，可用小室法或软琼脂趋化法，PMN或淋巴细胞作为指示细胞，以细胞趋化的程度来反映样品中IL-8活性水平。
6） 抗体形成法
IL-6可在体外刺激某些B淋巴细胞系产生和分泌免疫球蛋白，常用的指示细胞有分泌IgG的ARH-77、CESS和分泌IgM的SKW6.CL-4。在一定的条件下，待检样品中IL-6水平与培养细胞上清IgG或IgM水平正相关，通过标准IL-6的对照可推算出待检样品中IL-6的活性。
上一篇：细胞因子检测原理 下一篇：细胞因子检测技术应用 共3页: 上一页 1 [2] [3] 下一页 | | |
|
|
|
