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细胞因子检测方法分类

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-11-14 　本站论坛

（3）免疫化学测定法
　　这种方法是检测细胞因子蛋白质的抗原特性。免疫学检测法本法利用抗体对抗原表位的识别，测定的是可溶性细胞因子的抗原性。基本原理是细胞因子（或受体）与相应的特异性抗体（单克隆抗体或多克隆抗体）结合，通过同位素、荧光或酶等标记技术加以放大和显示，从而定性或定量显示细胞因子（或受体）的水平。这类方法的优点是实验周期短，少受抑制物或相似生物池功能因子的干扰，如抗体的特异性高可区分不同型或亚型的细胞因子（如IFN），一次能检测大量标本，易标准化。与生物学活性检测方法相比，免疫学检测法在许多情况下敏感性低于前者，所得结果不表示生物学活性，有的McAb只能识别重组的细胞因子，在检测天然的细胞因子中受到限制。　　
生物素、亲和素放大系统引入酶标测定系统后，大大提高了酶联免疫吸附测定（ELISA）法的灵敏度。若灵敏度选在高于本底信号2～3个标准差，目前多数细胞因子的ELISA试剂盒可测至5～10 ng/L，已接近生理浓度，也达到放免法的灵敏水平，因此，目前国外公司推出的细胞因子检测试剂盒，绝大多数都是采用ELISA法。
ELISA法的优点是特异、方便、易标准化和批量化，很适合临床应用。其缺点为提供的是免疫活性信息而不是细胞因子生物活性信息。细胞因子前体分子、细胞因子分解片断、细胞因子聚合物、细胞因子与结合蛋白或可溶性受体结合物、虽均无生物活性，但依然可为免疫化学法测定。除此之外，血清或体液中的嗜异性抗体、抗类风湿因子等自身抗体也能干扰测定结果。

检测细胞因子时绝大多数ELISA法使用以下3种策略：
　　1．间接ELISA（Indirect ELISA）：用于筛检抗体（抗特定抗原成分的特异性抗体）。此法是测定抗体最常用的方法。
　　2．夹心ELISA（Sandwich ELISA）：用于检测目的抗原的量。其优点是避免了对特异性抗体的直接标记，但增加了操作步骤和测定时间。
　　3．竞争ELISA（Competitive ELISA）用于确定抗原特异性或待检标本中含交叉反应成分时为了提高实验的特异性而使用的一种方法。根据标记抗原与同种未标记待测抗原与抗体间发生竞争性结合的原理，主要用于测定小分子抗原。
　　除了以上3种，直接法用于检测抗原或抗体（特别是总抗体浓度）方法已经不常用。实验中选用何种形式取决于实验的目的，特别是待检测标本的类型。
　　（1）ELISA（或RIA）夹心法
　　根据抗体性质和特异性不同可有以下几种不同的夹心法ILISA。
　　1） PcAb与McAb夹心法　
　　用纯化的多克隆抗体（PcAb）包被板子，加待检细胞因子（或可溶性受体）和标准品，上层加酶标记的McAb。有时为了增加敏感性，上层加McAb后再用酶标记第二抗体显色。
　　2） McAb与PcAb夹心法　
　　用McAb包被板子，加待检样品，上层加酶标记的PcAb。有时为了增加敏感性，上层加PcAb后再用钊对PcAb的酶标记抗抗体。
　　3）双McAb夹心法
　　选择和应用识别同一个细胞因子（或受体）分子上不同表位的两种McAb，其中一种包被板子，另一种McAb标记酶。由于单克隆抗体亲和力识别表位地匀一，从质量控制角度来看，一般比上两种夹心法易控制。如目前已商品化检测细胞因子（或其受体）的检测盒大多采用双单克隆抗体夹心法。
　　4）细胞、McAb夹心法
　　用表达IL-2R的MT-1细胞包被板子，加入待检IL-2或标准品，上层加125I标记的McAb，根据γ计数cpm值推算出待检IL-2含量。
　　特异性检测可溶性细胞因子或趋化因子一般采用夹心ELISA技术，细胞因子夹心ELISA的实验方法是用高纯度的抗细胞因子的抗体（捕获抗体）非共价吸附在塑料微孔板上。板子经过洗涤后，固定的抗体可特异性捕获样本中存在的可溶性细胞因子蛋白。洗涤未结合的物质，通过加生物素联接的抗细胞因子抗体（检测抗体）来检测被捕获的细胞因子，然后再加酶标记的亲合素或链亲合素。最后加显色底物溶液，显色的程度通过ELISA酶标检测仪测定光密度（OD：optical density）记录。通过细胞因子的标准蛋白做已知浓度系列稀释，测出OD值后绘制出标准曲线，根据标准曲线可推算出标本中细胞因子的含量，一般使用计算机软件可以很快得到结果
　　夹心ELISA法要有抗同一细胞因子不同表位的两个抗体。一个抗体用于包被作捕捉抗体用；另一个抗体分子作检测用，其分子上标记生物素。生物素分子与标记酶的亲和素分子结合。一般用单抗作包被抗体，用多抗或几个单抗混合起来作检测抗体，这样可以提高检测的灵敏度。
　　为了增加敏感性，在上述系统中可再连接上生物素，再用链霉亲和素（streptavidin）酶标记物进行放大。此外，还可用化学发光、改进显色底物等措施提高检测方法的敏感性。
　　用ELISA检测细胞因子时，首先要弄清所测细胞因子的性质和其存在形式与部位，正确解决标本选择、标本收集时间、污染防止和减少干扰等问题，才能获得满意结果。体内多数细胞因子在生理情况下，血中浓度极低，不宜用血标本测定。但一些经常性分泌的细胞因子，如红细胞生成素（EPO），粒细胞集落刺激因子（G-CSF）等，或某种病理情况下能引起其分泌亢进的细胞因子，可用血浆或血清直接检测。在某些病理情况下，一些细胞因子参与局部病变，这类细胞因子往往在局部体液中浓度升高，这种体液也可选为检测标本。细胞培养上清液是测定体外刺激培养细胞的细胞因子常用的标本。但收集上清液的时间，应考虑细胞因子分泌的动力学。
　　任何给定时点的细胞因子浓度，都是分泌和消耗及分解的总和，都是这一时点的瞬时结果。不同的细胞因子的分泌峰时不同。此外，产生细胞、活化剂种类、培养条件等不仅会影响分泌细胞因子的种类和分泌量，而且会影响峰值出现的迟早，为了获得稳定的结果，应严格控制。各种标本中一旦有细菌和其他微生物污染，在操作过程中就会引入新的干扰。当血液样品中受污染，内毒素含量达到10μg/L时，在37℃下放6小时就会显著分泌IL-1、TNFα、IL-6和IL-8，而这种污染程度肉眼尚难观察。有实验表明，肝素抗凝样品易受污染影响，其次是枸橼酸抗凝，而乙二胺四乙酸抗凝受污染影响最轻。此外，取样品后立即转入4℃保存也是降低污染影响的有效措施。
　　（2）竞争法
　　有报道用况争法检测IL-2水平。用免抗IL-2PcAb包袱板子，同时加入125I标记的IL-2和待测IL-2，根据γ计数cpm值得知待检IL-2对125I-IL-2与PcAb竞争结合的程度，从而推算出待测标本IL-2的含量。这种方法检测IL-2的敏感性可达50pg/ml。

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