（3） ELISPOT 未来展望
ELISPOT 分析技术正在欧美各国发挥它的完整潜能，它让免疫学家可以直接洞察活体内T细胞相关生理学或病理学，就像是心脏外科医师手上的那张心电图，经由这个技术科研人员可以在活体内直接进入一个器官系统，在那里视察、发掘，得到全新的智识。
从各国文献可见ELISPOT技术已经达到标准化、规范化的要求，并被广泛地应用在多项领域，包括监视癌症病人接受免疫疗程时的反应(Lewis, 2000 and Janetzki, 2000)，以及感染性疾病(Moss, 2000, Rahman, 2000, Rowland-Jones, 1998, Herr, 1997 and Lechner, 2000)、肿瘤(Nagorsen, 2000)、或自体免疫病人体内的一个特定的免疫反应型式(Pelfrey, 2000)。ELISPOT技术同时也在数个疫苗效价评估人体试验中，被当成重要的终结指针。2003年1月，世界卫生组织通过与大陆北京性艾中心合作，将应用ELISPOT技术来监测HIV疫苗研究免疫应答反应技术，该计划将是首次利用ELISPOT技术对亚洲国家从事HIV疫苗研究和临床试验的有关研究。我们期待未来此一技术能在我国免疫学界得到广泛地应用。
原理 ELISPOT就其原理来说实在是很简单的，从本质上说和ELISA的原理是一样的，理解起来并不难。细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT 底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。传统的ELISA与ELISPOT都是根据酶免疫学检测原理，通过酶的高催化频率，放大反应效果，从而达到很高敏感度的检测效果。
ELISPOT全名为Enzyme-linked Immunospot Assay，其技术原理与ELISA相似。其实验设计是在96微孔培养盘底部披覆PVDF薄膜，用来吸附特殊挑选、且无毒性（不含sodium azide、内毒素endotoxin）的单株抗体。静脉血PBMC细胞经适当分离处理后，会被分配到微孔盘上，再接受适当的抗原刺激，并将微孔盘放置于温箱中过夜培养一段时间。一般而言，记忆型T细胞在受抗原刺激数小时后会开始分泌细胞激素，此时局部(在紧靠分泌细胞的周围)分泌出的细胞激素会被PVDF薄膜上特异抗体捕获。微孔盘中的细胞被移除并清洗后，被捕获的细胞激素可进一步使用生物素（Biotin）标记的二次抗体来标志，其后再以结合酵素的StreptAvidin与之作用，并加入酵素受质使其呈色，有反应作用的细胞会留下染色斑点。
反应步骤可大致分为：
（1） 利用特定细胞因子的单克隆抗体包被96孔板，封闭剩余的空白位点；
（2） 加入细胞悬液，用特异性抗原刺激、活化细胞，产生细胞因子，细胞因子会往附近扩散与之前包被的抗体进行特异结合；
（3） 洗掉细胞；
（4） 加入酶标二抗特异与细胞因子进行结合，通过底物的显色反应，一个细胞所在位置就会显出斑点，最后利用显微镜或者特定的读板机（reader）就可以计算出样品中被激活细胞的数目。
以上是检测分泌细胞因子细胞的流程，如果是检测分泌特异抗体的细胞只需把包被特异抗体变为包被特异抗原即可。
上一篇：细胞因子检测技术应用 下一篇：ELISPOT技术实验步骤
共2页: 上一页 [1] 2 下一页
