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免疫酶组织化学技术

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-11-02 　本站论坛

自Nakane（1966）建立了免疫酶标记技术以来，这门技术发展很快，从酶标直接法，发展到今较为常用的PAP法、ABC法、SP法及PV两步法已有20种以上。与免疫荧光相比具有不需要特殊显微镜、染色标本可长期保存等优点。常用的标记酶为HRP、AKP及GO等。

1、直接法
是将酶分子直接标记在特异性一抗上进行检测，方法同免疫荧光直接法类似。仅用于单克隆抗体的筛选、酶联免疫吸附试验。

2、间接法
将酶标记在桥抗体上（也称二抗）与特异性一抗结合，再用酶底物进行显色的方法。非特异性染色重，只染色强度（敏感性）强于直接法，以很少应用。
酶桥法
PAP法
SPA-PAP
3、非标记抗体酶法 SPA-二抗-PAP(SAPAPAP)法
APAAP法
GAG法
(葡萄糖氧化酶抗葡萄糖氧化酶)
4、生物素—抗生物素蛋白检测系统
抗生物素蛋白是蛋白中的一种糖蛋白，分子量为68kD，具有四个结合位点，能与小分子生物素结合,亲合力极强。此原理原用于某些提取和层析工作，1979年建立了生物素－亲和素－生物素桥联（BAB)法，1981年许世明等在此基础上创立了亲和素－生物素复合物（ABC）法。
ABC-HRP法操作流程
1 石蜡切片脱蜡至PBS。
2 0.1％－0.05％胰蛋白酶消化30min。
3 PBS洗涤。
4 0.3％H2O2甲醇液或3％H2O2室温孵育20min。
5 二抗同源正常血清(5-10%)室温孵育20min。
6 不洗，滴加适当稀释的一抗370C 60min或40C过夜。
7 PBS洗涤。
8 ABC复合物1:100－1:150（A和B液于临用前等量混合） 370C 60min或40C过夜。
9 PBS洗涤。
10 DAB(0.04%)显色（镜检控制），水洗、复染、封片。

5 生物素－链霉卵白素检测系统

6 第二代聚合酶两步法（ PV，En Vision)
• PV－9000是2001年投入美国市场的，2002年由北京中杉金桥生物技术有限公司（原北京中山）引入中国，它是将二抗抗体分子的单价Fab段与酶聚合在一起，与一抗结合后，直接用底物进行显色的方法。此方法由于简单、快速、敏感性强且避免了内源性生物素所造成的背景染色，以有逐渐取代其他免疫酶组织化学检测方法的趋势。
PV法操作流程
1石蜡切片脱蜡至PBS。
2 0.3％H2O2甲醇液或3％H2O2室温孵育20min。
3 抗原修复。
4滴加适当稀释的一抗370C 60min或40C过夜。
5 PBS洗涤。
6 酶标记二抗370C 30min或室温60min。
7 DAB(0.04%)显色（镜检控制），水洗、复染、封片。

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