| 免疫病理学技术应注意的关键问题 | | 点击： 作者： 来源： 时间： 2007-11-02 本站论坛 |
|  | 2、免疫组化染色注意事项
A、组织处理方面
B、抗体的保存和配制
C、正确设置各种对照
D、出现假阳性的分析
E、出现假阴性的分析
F、出现背景着色分析
G、显色剂的合理应用
H、染色结果正确判断
（一）、组织处理方面：
恰当的组织处理是做好免疫组化染色的先决条件，也是决定染色成败的内部因素，在组织材料准备的过程中，不仅要求保持组织细胞形态完整，更要保持组织细胞的抗原不受损或弥漫，防止组织自溶。出现自溶坏死的组织，抗原已经丢失，即使用很灵敏的检测抗体和超高的技术，也很难检出所需的抗原，反而往往由于组织的坏死或制片时的刀痕挤压，在上述区域易出现假阳性结果。
1、组织及时取材和固定
组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步，离体组织最好2小时内能有效防止组织自溶坏死，抗原丢失。取材的刀应锐利，组织块宁可面积大，千万不能厚的原则，使蛋白在固定液内迅速凝固。从而完好的保存抗原和组织细胞形态。
对于固定液的选择，从原则上讲，应根据抗原的耐受性选择相应的固定液，但在病理常规工作很难做到这一点，因诊断和鉴别诊断都是在常规HE病理诊断的基础上决定是否进行免疫组化的染色，而常规组织处理是采用4%中性甲醛4倍于组织体积，利用其渗透性强最好在12小时内进行组织固定，否则长时间固定会对组织抗原的检出强度将逐渐降低。
2、组织脱水、透明、浸蜡
掌握的原则是脱水透明要充分;但不能过，浸蜡时间要够,温度不能高，否则切片困难，即使能切片也使切片不能完好平整，染色过程中极易脱片，免疫组化染色抗原的定位及背景都不利，所以正常大小的组织在无水酒精脱水1小时X3次，二甲苯透明1小时即可，浸蜡及包埋石蜡温度不要超过63℃。
（二）、切片方面
在切片之前还应对玻璃片进行处理，由于我们检测抗原是多种多样的，要进行各种抗原修复处理，如微波、高压、水溶酶等，玻片如果得不到很好的处理，将易造成脱片。为保证免疫组化实验的正常进行，必须在清洗干净的玻片上进行粘合剂的处理以防脱片。切片时保持刀锐利，切片要完整、厚薄均匀、无皱褶、无刀痕，如有上述问题在进行免疫组化染色都将出现假阳性现象，切好的切片在60℃温箱中烘烤，温度不宜过高，否则易使组织细胞结构破坏，抗原标记定位弥漫现象。
1、明胶－铬明矾法
2、APES（3-氨丙基-乙氧基甲硅烷）
3、Poly-L-Lysin（多聚左旋赖氨酸）
明胶－铬明矾粘片剂
• 洁净干燥之载物片浸在0.5％明胶＋0.05％铬明矾液内，370C 1 min,空气干燥；用0.2％戊二醛（PBS配) 固定20min，PBS洗后，切片空气干燥后于40C冰箱保存。
• （先将明胶于600C溶解，再加入铬明矾。）
（三）、免疫组化染色方面
免疫组化染色方法已不是什么很难的问题，操作步骤简单也易掌握,但要染好免疫组化,其中方法的技巧将是每位操作者在实际工作不断摸索和探讨的事,但最基本的应从以下方面加以注意。
1 实验设计
• 根据课题要求，通过查阅文献选出具有代表意义的较新的抗体，通过合适的联系方式确定抗体的出处，购买方式及到货日期。在每次染色或每一批染色前，都应列出实验计划，做好免疫组化标记记录单，拿到的任何一种抗体都应首先进行预实验，以确定正式实验中抗原的修复方式、抗体的最佳稀释度及孵育时间等，然后才能进行大批的实验。
2、抗体稀释度
A、抗体的浓度
B、抗体溶液中非特异物质的含量
C、孵育时间
D、免疫组织化学染色方法
E、抗体的质量及有效期
F、抗体稀释液的种类
3、抗体稀释度的测定方法
直接法
4、抗体的配制
• 根据一次实验所需的抗体量（切片的多少、组织的大小及孵育时间来）来决定配制的抗体量。
• 配制抗体的微量加样器一定要精确，最好专用。
• 大包装的抗体要进行分装、密封，现用现取，用前稀释。
• 抗体分装时，尽量在洁净的环境下无菌操作。
免疫组织化学染色对照的设计
自身对照
空白对照
阴性对照 替代对照
抑制对照
吸收实验对照
阳性对照
非特异性染色及消除方法
导致非特异性染色的因素
• 靶组织或靶细胞 ：自发荧光、内源性过氧化物酶、内源性生物素及色素。
• 标记物 ：荧光抗体不纯、荧光标记过量，酶标抗体中的酶纯度不够、标记过量、抗体自身不纯及含有该抗体以外的成分等。
1、去除内源酶
一般我们进行免疫组化标记的都是一些生物体组织，其中自身含有一定量的内源性酶，酶的作用是催化底物，使显色剂显色，而组织中的内源性的酶同样也能催化低物，使其显色，这就影响免疫组化的特异性，所以在酶标记抗体进入组织切片之前就应设法将组织内的各种内源性酶灭活，以保证免疫组化的染色是在特异性情况下进行。
A、去除内源性过氧化物酶
3%过氧化氢水溶液或0.3－3％过氧化氢甲醇液孵育10－20min。方法比较通用易操作，用过氧化氢时浓度不能过高，一般为3-5%，时间最好10分钟。
B、灭活碱（酸）性磷酸酶：
最常用的方法是将左旋咪唑（以每毫升加24mg）加入底物液中并保持pH值为7.6—8.2能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶可用0.05mol/L酒石酸抑制。
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