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免疫组化技术之免疫酶法

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-11-12 　本站论坛

        免疫酶法是借助酶细胞化学等手段显示组织抗原（或抗体）的新技术，是在免疫荧光法的基础上发展起来的。免疫酶法的基本原理与免疫荧光法有所相似，免疫酶法是将酶以共价键的形式结合在抗体上，制成酶标抗体，再借助酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于光镜或电镜下进行细胞表面或细胞内部各种抗原成分的定位。已如前述，免疫荧光法具有操作简便、灵敏、特异性高、省时的优势，但同时也具有令人遗憾的不足，特别是荧光标本不能长期保存以及需要价格昂贵的荧光显微镜才能观察的问题。为此，Nakane等人（1966）尝试了用酶代替荧光素来标记抗体的方法，从而成功地开创了酶标记抗体的新技术（酶标抗体法）。Sternbenger等人又将非标记抗体过氧化物酶法成功地引人，使免疫酶法有了很大的进步，成为当今使用最为广泛的免疫组织化学技术。
      免疫酶法与免疫荧光法相比较，具有以下优点：酶反应产物呈现的颜色不仅能在一般的普通生物显微镜下观察，而且其产物因具有一定的电子密度也可在电镜下观察（免疫电镜技术），光镜与电镜的结合，使灵敏度进一步提高，标本又能长期保存，并能加设HE染色等其他复染，有利于将被检测物质与病变的形态学改变联系起来（定性与定位），弥补了免疫荧光法的不足。
      从理论上讲，用细胞化学方法能显示的酶，均可用于标记抗体进行免疫酶法染色，但实际上能用于免疫组织化学技术的酶并不多。sternbenger等人指出：用于标记的酶应具备以下六点：
      1）酶催化的底物必需是特异的，而且容易被显示，即催化反应所形成的产物易于在光镜和电镜下观察。
      2）酶反应的终产物所形成的沉淀必须稳定，即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散，而影响组织学定位。
      3）较易获得纯的酶分子。
      4）中性PH值时，酶分子应稳定。
      5）在酶标过程中，酶连接在抗体上，不能影响二者的活性。
      6）被检组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似的物质，否则结果将难以判定。
      上述六点中以1．2两点最为重要，因为并非所有的容易显示的酶均能形成不溶性的复合物。符合上述要求的，最为常用的酶是辣根过氧化物酶（Horseradish  Peroxidase，H：：flJ）。其次是碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP），除此两种外，还有葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GOD）等，但因其形成的不溶性色素扩散作用较大，在应用上受到很大限制。 HRP广泛分布于植物界，因其辣根含量最高而得名。它是由无色酶蛋白和深棕色的铁叶结合组成的一种糖蛋白（糖占18％左右），分子量为40000道尔顿，等电点3~9，最适 PH为 5.0左右。HRP易溶于水和58％以下的饱和硫酸铰溶液，其活性部分为铁叶琳，称辅基。酶的蛋白部分无活性。酶蛋白和铁叶琳辅基的最大吸收光谱分别为275urn和403urn；HRP的纯度用两者的光密度比值（M03人工卫75）来衡量，以RZ（Reinheitzahi）来表示。一般认为，标记酶的RZ值为 3.0左右，不应＜2.8，RZ值越小，酶的纯度越差，对于纯度低，质量差的酶，需经纯化后才能使用。
      AKP是一种磷酸酶的水解酶，磷酸单酯酶对于连接于作用物磷酸基上的醇基没有特异性，因它可以水解多种有机磷酸酯，生成醇和磷酸盐离子。该酶在许多人体组织或动物组织中有分布，如肝、胎盘、白细胞、肾、小肠等。AKP的分子量为80KD，最适PH为9.8，其活性受底物及浓度、缓冲液及其离子浓度等因素影响，如用二乙醇胺缓冲液（1mol／L，PH9.8）对AICI’具有活化作用，酶的活性高，而用甘氨酸一NaOH缓冲液则对AKP有抑制作用。AKP的活化剂有镁和锰离子，Mg++的适应浓度为10mol/L。甘氨酸、柠檬酸盐，EDTA等对 AKP有抑制作用。AKP对温度具有较高的敏感性，从 25℃增加到 35℃，其催化反应速度增加 1.5倍。当选用不同的底物时，AKP可催化形成不同颜色的终产物。例如，萘酚一AS一MX和快蓝（Fast blue，Fh）为底物时生成蓝色产物，可与HRP催化的产物形成鲜明的对比，用快红（Fast red）代替快蓝则生成红色不溶性产物，而且内源性AKP较易清除，可以较好地避免内源性酶的干扰，使其具备了某些独特的优点而日益备受重视。
      GOD所催化的底物为葡萄糖，电子供体为对硝基蓝四隆（Paranitroblue Tetrazolium），终产物比较稳定，为不溶性的蓝色沉淀。从理论上讲，GOD较AKP和HRP为佳，因为哺乳动物组织内不存在内源性葡萄糖氧化酶，这样可以很好地避免内源性酶的干扰。但是，GOD的分子较HRP大三倍，具有较多的氨基，在标记时易形成广泛的聚合，而影响酶的活性。
      免疫酶法与免疫荧光法大致相同，也可以分为以下几种。
      （1）直接法
      用酶标记的特异性抗体直接与标本中的相应抗原反应结合，再与酶的底物作用产生有色的产物，沉积在抗原抗体反应的部位，即可对抗原进行定性、定位以至定量研究。
      直接法的第一步是特异的——即酶催化底物的反应，其余步骤则是非特异的，可用各种电子供体介导。以HRP为例，HRP的底物是巴H2O2，在分解已过程中，与H2O2形成初级复合物，无电子供体存在时，反应不再继续进行，当电子供体存在时，反应以一定的速度形成第二种复合物，继之HRP催化H2O2所形成的中间型产物，迅速生成水，酶被还原，电子供氢体被氧化，聚合，再经氧化环化，最后形成引哚胺多聚体，于酶反应部位，形成不溶性棕褐色沉淀，与组织对比清晰，达到定位、定性、定量的目的。
      直接法简便、快速、特异性强，非特异性背景反应低。其缺点是，每种抗原必须分别用其抗体的酶标记物，且敏感性较间接法低。

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