1)水浴加热法
将脱蜡人水后的切片放人盛有修复的容器中，放人加热煮沸水中，当修复液温度达到95℃左右时计时l5min，自然冷却，PBS洗3min×3次。
2)微波加热法
将切片放入修复液中微波加热使温度在96℃左右，计时l0min，在微波炉中停留2min，室温自然冷却，PBS洗3min×3次。
3)高压加热法
将修复液在高压锅中煮沸，切片插在染色架上，放入锅中(要使修复液淹没切片)开始喷气时盖上压力阀。计时2min，冷水冲至室温取出切片，PBS洗3min×3次。
（5） 显色
免疫组化染色的显色是最后的关键问题，一般辣根过氧化物酶(HRP)的检测系统选用DAB或AEC显色系统进行显色。但要得到最佳的显色效果，必须在镜下严格控制，以检出物达到最强显色而背景无色为最终点，尤其DAB显色时间短着色浅，时间长背景又深，都将影响结果判断，根据经验DAB在配制完后最长宜放置30min以内，过时不能使用，DAB加到组织切片时作用时间最长不宜超过10min(最好在5min内)，否则不管有无阳性都应终止反应。对一些含有内源性酶较高的组织用DAB显色时极易出现背景色更应尽早在镜下控制，以达到最佳的分辨效果（棕色）。AEC显色系统（红色）的弊端是易溶于有机溶剂，所以封片时应以水性封片剂为主，同时染色的切片也不能久存。
如果是碱性磷酸酶(AP)最好选用NBT/BCIP作为显色系统（结果染为蓝黑色）。
（6） 结果判断 免疫组化的结果判断有两种方法：
一是对以检测结果阳性细胞指数来定性(如核抗原的标记)，判断方法是以一个视野中的阳性细胞数与总细胞的百分比，再取10个相同视野算取平均指数。
另一种方法以染色阳性强度和阳性检出率相结合而定，一般阳性细胞数在0~25为阴性，25~50为十，50~75为十十，75以上为十十十。此种判定方法容易出现人为误差现象。
有条件的实验室最好能用图像分析系统进行结果检测定量分析更为准确。一切的判定方法都是力求使免疫组化染色结果判断更标准，但各单位采取的标准不尽相同，所以判断标准化问题还有待长期实践中病理学术界商讨判定标准。
IHC中常见的抗原表达模式有以下几种：
1）细胞浆内弥漫性分布，多数胞浆型抗体的反应如此，如细胞角蛋白(cytokeratin，CK)和波形蛋白(vimentin)等；
2）细胞核周的胞浆内分布，其判别要点是细胞核的轮廓被勾画得很清楚，如CD3多克隆抗体的染色；
3）胞浆内局限性点状阳性，如CDl5抗体的染色；
4）细胞膜线性阳性，大多数淋巴细胞标记的染色如此，如CD20、CD45RO；
5）细胞核阳性，如Ki-67及雌、孕激素受体蛋白ER、PR等。一种抗体可同时出现细胞浆和细胞膜的阳性表达，如EMA可呈膜性和胞浆内弥漫性阳性反应；CD30抗体可同时呈膜性和胞浆内点状阳性反应等。
（7） 对照片的设置 免疫组化的质量取决于正确使用各种对照，没有对照的免疫组化结果是毫无意义的。对照包括阴性对照、阳性对照和自身对照。在实践中可用染色组织切片中不含抗原的组织作为阴性对照，而用含抗原的正常组织作阳性对照，这种自我对照具有节约的意义。观察染色结果时，先观察对照组织的结果，如阳性对照组织中阳性细胞呈强阳性，阴性对照细胞呈阴性，内源酶阴性，背景无非特异性染色时，表明本次实验的全部试剂和全过程技术操作准确无误，待检组织中的阳性细胞也就是可信的正确结果。 免疫组化染色中对照片的设置非常重要，它是判断您的染色是否成功的关键依据，而且也是检测每一个抗体的质量标准，常设的对照如下，一般实验最常用的只选第二种方法。
1）空白对照(阴性对照) 第一抗体由PBS或非免疫血清取代。
2）阳性对照 用已知含有要检测抗原的切片作阳性对照。
3）回收实验阴性对照 已知抗原与相应的第一抗体混合，发生结合沉淀，再用此沉淀抗体复合物进行免疫组化实验，结果为阴性。
4）替代对照 用于第一抗体同种动物的血清或无关抗体代替第一抗体结果为阴性。
5）自身对照 在同一切片上，应将不同组织成分中的阳性或阴性结果与检测的目的物对照比较。如actin、CD34在正常组织中的血管壁肌层应为阳性，vimentin可以间质细胞，对照desmin以血管壁及肌束为对照，S-l00蛋白以小神经末梢为对照等，如果应为阳性的组织是阳性，则免疫组化技术正确，如为阴性，则表明染色技术有问题或免疫试剂质量有问题。
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