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免疫组织化学技术介绍

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-11-20 　本站论坛

（二）辨认细胞产物
利用某些细胞产物为抗原制备的抗体，可作为相应产物的特殊标记，如内分泌细胞产生的各种激素，大多数可用免疫组化技术标记出来，据此可对内分泌肿瘤作功能分类，检测分泌异位激素的肿瘤等。
（三）了解分化程度
大多数标记物都有其特定的分布部位，如上皮细胞膜抗原（EMA）着色部位在细胞膜上，但差分化乳癌胞浆内也可出现阳性颗粒；角蛋白的含量也与分化程度有关，低分化或未分化癌含量较低、染色较弱。
（四）鉴定病变性质
通过标记Ig轻链（κ、λ）可区分部分B细胞性淋巴瘤与B细胞反应性增生，前者常表达单一的Ig轻链（κ+/λ+），后者常为多克隆Ig轻链（κ+、λ+）。而标记bcl-2蛋白在区别滤泡型淋巴瘤和反应性滤泡增生上有相当的意义。在滤泡型淋巴瘤，90%以上肿瘤性滤泡细胞有bcl-2的高表达；而在滤泡反应性增生时，滤泡反应中心的细胞不表达bcl-2蛋白，而套细胞则表达。
（五）发现微小转移灶
某些癌的早期转移有时与淋巴结内窦性组织细胞增生不易区别。用常规病理组织学方法要在一个组织中认出单个转移性肿瘤细胞或几个细胞是不可能的，而采用免疫组化方法（如用上皮性标志）则十分有助于微小（癌）转移灶的发现。对转移性肿瘤也可借助免疫组化标志寻找原发瘤，如骨组织内有前列腺特异性抗原阳性细胞，提示前列腺癌转移。
（六）探讨肿瘤起源或分化表型
一些来源不明的肿瘤长期争论不休，最后通过免疫组化标记取得共识。如颗粒性肌母细胞瘤，曾被认为是肌源性的，但该肿瘤肌源性标记阴性，而神经性标记阳性，证明为神经来源（可能来自神经鞘细胞）。分化很差的肿瘤病理上常按细胞形态分为梭形细胞肿瘤、小圆细胞肿瘤等，通过多种标记的联合应用，也可能确定来源。
（七）确定肿瘤分期
判断肿瘤是原位还是浸润及有无血管、淋巴管侵袭与肿瘤分期密切相关。用常规病理方法判断有时是十分困难的，但用免疫组化法可获得明确结果。如采用层粘连蛋白和Ⅳ型胶原的单克隆抗体可清楚显示基底膜的主要成分，一旦证实上皮性癌突破了基底膜，就不是原位癌，而是浸润癌了，其预后是不同的。用第八因子相关蛋白、荆豆凝集素等显示血管和淋巴管内皮细胞的标记物则可清楚显示肿瘤对血管或淋巴管的浸润。对许多肿瘤的良恶性鉴别及有无血管或淋巴管浸润，这是主要的鉴别依据，同时也有治疗及预后意义。
（八）指导治疗和预后
免疫组化标记中与预后有关的标记大致可分为三类：①类固醇激素受体：如雌激素受体、孕激素受体等，它们与乳腺癌的关系已获公认，性激素受体阳性者内分泌治疗效果较好，预后也较好。相似的结果也见于子宫内膜癌和卵巢癌。②肿瘤基因标记：如癌基因c-erB-2，c-myc，P53蛋白等，在肿瘤中高度表达者，患者预后较差；而nm23蛋白高度表达者，肿瘤转移率较低，预后较好。③细胞增殖性标记：如表皮生长因子受体（EGFR）、增殖细胞核抗原（PCNA）、Ki-67等，表达指数越高，表明其增殖越活跃，恶性度增高，预后不良，其中以恶性淋巴瘤、乳腺癌较为明显。而且在乳腺癌的研究中发现Ki-67、 PCNA 、EGFR阳性者，淋巴结转移率高，并与激素受体的表达呈负相关。
（九）辅助疾病诊断和分类
人体的免疫性疾病，主要是自身免疫性疾病，如肾小球肾炎、皮肤自身免疫性疾病等，可用免疫组化方法对组织细胞内的免疫球蛋白、补体、免疫复合物等进行检测以辅助诊断。某些疾病的分类或分型也是在免疫组化基础上建立的。内分泌肿瘤如垂体前叶腺瘤，根据其分泌功能可分为生长激素腺瘤、泌乳激素腺瘤等10型；胰岛细胞瘤的功能分类为胰岛素瘤、高血糖素瘤等6种；恶性淋巴瘤根据瘤细胞表面标志不同可分为T细胞性、B细胞性。肾小球肾炎的免疫学分类亦需免疫组化或免疫荧光技术。
（十）寻找感染病因
人体疾病的致病微生物中有的在常规病理检查中不易发现，尤其是病毒性致病微生物，由于其分子水平的结构，在细胞水平上难以发现，通过免疫组化方法则可明确发现病原体抗原部位以及定量，如巨细胞病毒（CMV）、人乳头状瘤病毒（HPV）、单纯疱疹病毒（HSV）、乙型肝炎病毒（HBV）等，已有商品化标志物帮助解决病因诊断问题。

三免疫组化技术的关键问题

（一）组织处理
恰当的组织处理是做好免疫组化染色的先决条件，也是决定染色成败的内部因素，在组织细胞材料准备的过程中，不仅要求保持组织细胞形态完整，更要保持组织细胞的抗原性不受损或弥漫，防止组织自溶。如果出现自溶坏死的组织，抗原已经丢失，即使用很灵敏的检测抗体和高超的技术，也很难检出所需的抗原，反而往往由于组织的坏死或制片时的刀痕挤压，在上述区域易出现假阳性结果。
1 组织及时取材和固定组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步，是有效防止组织自溶坏死，抗原丢失的开始，离体组织应尽快的进行取材，最好2h内，取材时所用的刀应锐利，要一刀下去切开组织，不可反复切拉组织，造成组织的挤压，组织块大小要适中，一般在2.5cm×2.5cm×0.2cm，切记取材时组织块宁可面积大，千万不能厚的原则，(也就是说组织块的面积可以大到3cm×5cm，但组织块的厚度千万不能超过0.2cm，否则将不利于组织的均匀固定)。固定液快速渗透到组织内部使组织蛋白能在一定时间内迅速凝固。从而完好的保存抗原和组织细胞形态。
对于固定液的选择，原则上讲，应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液，但除非是专项科研项目，在病理常规工作很难做到这一点，因为病理的诊断和鉴别诊断都是在常规HE病理诊断的基础上决定是否进行免疫组化的染色，而HE染色的常规组织处理是采用10%的中性缓冲福尔马林或4%缓冲多聚甲醛4倍于组织体积进行组织固定，利用其渗透性强，对组织的作用均匀进行固定，但组织固定时间最好在l2h内，一般固定时间不应超过24小时。随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。
2 组织脱水、透明、浸蜡组织经固定后进行脱水、透明、浸蜡和包埋。掌握的原则是脱水透明要充分但不能过，浸蜡时间要够，温度不能高，否则造成组织的硬脆使组织切片困难，即使能切片，由于组织的硬脆，也使切片不能完好平整，染色过程中极易脱片，对免疫组化染色抗原的定位及背景都不利，所以无水酒精脱水和二甲苯透明的时间不宜过长，正常大小的组织无水酒精脱水lh×3次，二甲苯透明lh×2次即可，浸蜡及包埋石蜡温度不要超过65℃。

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