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免疫组织化学技术介绍

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-11-20 　本站论坛

4 抗原修复经甲醛固定的部分组织细胞，可使免疫组化标记敏感性明显降低，这是因为甲醛固定过程中形成醛键或保存的甲醛会形成羧甲基而封闭部分抗原决定簇。因此，在染色时，有些抗原需先进行修复或暴露。
抗原修复方法可分为化学方法和物理方法。化学方法是以酶消化方法，常用胰蛋白酶及胃蛋白酶，配制浓度与消化时间要适度。常用的物理方法有单纯加热、微波处理和高压加热。在选用这三种加热法时，浸泡切片的缓冲液的离子强度和PH值、加热的温度和时间均影响着抗原修复效果。目前最常用的修复方法有如下凡种：
4．1 胰蛋白酶(Trpsin) 主要用于细胞内抗原的修复。一般使用浓度为0.1%，37℃作用10min。配法：0.1g胰蛋白酶加入到0.1%pH7.8CaCl2(无水)水溶液中溶解后即可。
4．2 胃蛋白酶(Pepsin) 主要用于细胞间质或基底膜抗原的修复。一般浓度为0.4%，37℃作用30min。配法：0.4g胃蛋白酶溶于0.lmol/L HCl水溶液中。
4．3 热引导的抗原决定簇修复(Heat Induced Epitope Retrieval，HIER) HIER对大多数的抗体有益，尤其是对核抗原的修复作用更加明显，最常用的抗原修复液是pH6.0的枸橼酸缓冲液和pH8.0的EDTA缓冲液，它们的作用原理是通过钠离子的螯合而实现的。抗原修复液的pH值非常重要，有效的抗原修复pH值要比修复液的化学成分更重要，同样的修复液随着pH值的升高染色的强度逐渐增强，但最佳pH值范围为6.0~10.0，对于大多数抗原这个范围的pH值都能进行有效的修复，有些抗体(如Ki-67、ER)则在pH值l.0~3.0和6.0~8.0更为有效。作为通用修复液碱性pH值的修复液要比酸性的有效，而对固定很长时间旧的存档组织，酸性pH值的修复液则优于碱性的修复液，所以两种抗原修复液可作为相互替补的进行抗原修复。在进行HIER过程中应防止切片的干燥，加热时必须达到规定的温度，保温时间要足够，对于一些不要抗原修复的抗体最好不要采用HIER处理，否则对染色无益，但有些抗体则需要利用多种修复联合应用。HIER方法有：
4．3．1水浴加热法将脱蜡人水后的切片放人盛有修复的容器中，放人加热煮沸水中，当修复液温度达到95℃左右时计时l5min，自然冷却，PBS洗3min×3次。
4．3．2微波加热法将切片放入修复液中微波加热使温度在96℃左右，计时l0min，在微波炉中停留2min，室温自然冷却，PBS洗3min×3次。
4．3．3高压加热法将修复液在高压锅中煮沸，切片插在染色架上，放入锅中(要使修复液淹没切片)开始喷气时盖上压力阀。计时2min，冷水冲至室温取出切片，PBS洗3min×3次。

5 免疫组化试剂的标准化
要求试剂公司提供标准化的试剂，并附详细的试剂说明书，包括抗体的来源、免疫球蛋白的亚类、单抗或多抗、使用稀释度、使用流程和注意事项、洗涤时缓冲液的适宜离子强度和PH值等。抗体的选择是开展免疫组化最重要环节之一。
目前，抗体大部分来源于国外，抗体种类繁多，生产厂家各异，再经过中介渠道致有效期缩短，影响抗体效价甚至阳性不表达，因此对购入的抗体首先要进行检测。理想的抗体应具备特异性强、敏感性高和适应性强的特点。
现实市场销售的一抗多为即用型，对抗体的滴度无须摸索，但对于浓缩型一抗，则应摸索出最佳的工作滴度，抗体的浓度过高或过低都将可能出现阴性结果，应该用一个适当的稀释度得到最佳的抗原染色强度和最低的背景着色。灵敏度高而极易控制背景的检测系统试剂盒是最为理想也是免疫组化染色优劣的关键，根据免疫组化技术发展至今第三代SP试剂盒更优于其它试剂盒 (ABC、PAP等)。但应注意检测系统应与一抗来源相匹配，否则检不出目的物。一抗的作用时间最好是4℃过夜，也可以用37℃lh，但后者在染色过程中应控制好温度、时间及其它抗体稀释度。
5．1抗体选用一般来讲，多克隆抗体的抗原专一性较差，非特异性反应较明显，效价不太稳定；但多克隆抗体制备简便，价格低廉，抗体效价较高，稀释度一般在1∶100~1000之间，适应性强，有部分多抗表达抗原特异性较好，如TG和PSA等，多抗CD3对石蜡切片标记T细胞适应性强，阳性率高。单克隆抗体的抗原专一性强，质量和效价稳定，非特异性反应较少，标记结果可靠，但单克隆抗体制备复杂，价格昂贵，抗体效价较低，稀释度在1∶50~100，如单抗CD3只能在冷冻切片上表达，难在石蜡切片显色。目前市场上常有分装、稀释抗体出售，这种抗体有使用经济的优点，但稀释抗体减少了蛋白分子间互相保护的作用，因而效价不稳定，不易长期保存。进口试剂质量较好，但价格昂贵，特别是常用的第二抗体，染色过程短，敏感性高。因此，应根据实际需要选择合适的抗体。
5．2抗体分装购入的抗体（除非只够数次用量）一般需要分装在多个安瓿中，根据月需要量，大致每安瓿含5~20微升。除留下一支现用，其余应立即放置低温冰箱内贮存（-20℃以下）。用一支取一支，以免长期保存在4℃冰箱内失效。
5．3抗体稀释抗体使用一般按其工作浓度稀释，如1∶100，1∶1000等等。一次用不完的抗体可保存在4℃冰箱内，尽量在1~2月内用完，而不要放在4℃冰箱的冰格中，因为温度在0℃以下，抗体会很快结冰，再次使用时又要融化，这样几次冻融，抗体效价会急剧下降而失效。用作抗体的稀释液，在夏天温度很高时，最好加入少许防腐剂如叠氮钠、柳硫汞等，以免在切片上作用时间超过10小时而生霉菌。
5．4无菌与消毒保持使用中的抗体无菌是困难的，但是与抗体接触的工具如滴管、吸管、试管、安瓿以及加样器等最好经过消毒，尽量减少污染的机会，不然抗体极易污染细菌与霉菌，而迅速发生浑浊沉淀而失效。

6 显色免疫组化染色的显色是最后的关键问题，一般辣根过氧化物酶(HRP)的检测系统选用DAB或AEC显色系统进行显色。但要得到最佳的显色效果，必须在镜下严格控制，以检出物达到最强显色而背景无色为最终点，尤其DAB显色时间短着色浅，时间长背景又深，都将影响结果判断，根据经验DAB在配制完后最长宜放置30min以内，过时不能使用，DAB加到组织切片时作用时间最长不宜超过10min(最好在5min内)，否则不管有无阳性都应终止反应。对一些含有内源性酶较高的组织用DAB显色时极易出现背景色更应尽早在镜下控制，以达到最佳的分辨效果（棕色）。AEC显色系统（红色）的弊端是易溶于有机溶剂，所以封片时应以水性封片剂为主，同时染色的切片也不能久存。

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