蛋白等电聚焦凝胶电泳技术- 点击： 作者： 来源： 日期：2007-04-09 本站论坛
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灌胶步骤：1）如右图组装灌胶器，灌胶前梯度混合器的腔间阀和流出管的夹子都应该关闭；
2)将7.5ml（视凝胶大小而定）轻液（碱性）注入梯度混合的贮液腔，小心打开腔间阀，赶去腔间气泡，再关上腔间阀；3）将同样体积的重液注入梯度混合器的混合腔，两腔中分别放入同样大小的搅拌子，在贮液腔放入补偿棒，此时两腔中液面应相平；4）将梯度混合器置于磁力搅拌器上，将流出管插入灌胶模具中央，梯度混合器的出口与流出管末端高度应该相差5cm，磁力搅拌器转速为200-500r/min；5）两个腔中加入TEMED，然后加入过硫酸铵，打开流出管的夹子，当酸液流到流出管的一半时，打开腔间阀，两腔液面同时下降，在混合腔混匀后缓缓注入垂直放置的模具中；6）灌注完毕后，室温静置5-20min（可用异丙醇封胶）于50度烘箱中聚合，灌胶后立即洗净梯度混合器，以免堵塞腔间阀；7）聚合约需要1h，完成后，取出凝胶，标上正负极；8）将凝胶称重后放入双蒸水中（6×10min或3×1h），室温下60次/分震摇以洗去催化剂和未聚合的单体；9）用冷风吹胶至于洗胶前重量相差小于1％。
样品制备和上样
固相pH梯度等电聚焦的样品处理方法同载体两性电解质等电聚焦的样品处理方法基本相同，而且要求比载体两性电解质等电聚焦的样品处理方法还要低，由于pH梯度在凝胶中已经固定，所以样品中的盐对pH梯度影响不大。
固相pH梯度等电聚焦通常为水平电泳，没有垂直电泳的加样孔，由于每个蛋白质被浓缩在其等电点位置，理论上将样品加在凝胶中的任意位置均能得到相同结果，但实际操作还是应避免将样品加在紧靠电极的位置或靠近等电点的位置。
等电聚焦电泳
以Pharmacia公司IPG－Phor系统为例进行说明：
1）打开循环水浴，设置冷却温度为10度；2）将固相pH梯度凝胶铺在冷却板上，在凝胶和冷却板之间可涂以液体石蜡或煤油以避免气泡产生，使二者之间接触良好；3）参见下表选择合适的电极液，以电极液润湿滤纸电极条，分别置于凝胶的酸、碱侧：
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