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聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-04-09 　本站论坛

阴极 1mol·L^-1氢氧化钠（NaOH）：称取4g固体溶于100ml重蒸水中。
（3）固定液：甲醇35ml，三氯乙酸10g，磺基水杨酸3.5g加水定容到100ml。
（4）染色液：乙醇35ml，冰乙酸10ml，考马氏亮蓝R2500.1g加水定容到100ml，溶解后过滤备用。
（5）脱色液：乙醇25ml，冰乙酸10ml，加水定容到100ml。
（6）保存液：甘油1—5ml，乙醇25ml，冰乙酸10ml，加水定容到100ml。
（7）样品：牛血清蛋白 1mg·ml^-1，糜蛋白酶元A 1mg·ml^-1，肌红蛋白 1mg·ml^-1，卵清蛋白 1mg·ml^-1，标准等电聚焦样品。
（8）大鼠肌肉提取液：1g鼠肌肉，加水5ml，匀浆提取，离心取上清液透析备用。
（9）10%过硫酸铵：称1g溶在10ml重蒸水中（纯过硫酸铵溶解时会有响声）。
四、操作步骤：
1．凝胶配制
单体贮液2.0ml，重蒸水5.3ml，载体两性电解质0.6ml，真空抽气15min后加TEMED（原液）8μl和10%过硫酸铵60μl，混匀立即灌胶。
2．灌胶
（1）准备
● 取3mm洗净晾干的玻璃板，涂上一层薄薄的防水硅油，以重蒸水冲洗，使硅油分布均匀。
● 平板电泳槽调水平，电泳槽上放上一张滤纸。
● 滤纸上放一厚2mm的玻璃板，玻璃板上面放上塑料模具（参看图20-3（a））。
● 用文具夹将模具和玻璃板固定在平板电泳槽上。
● 在模板上面，文具夹的另一端再放上涂有硅油的玻璃板。
（2）灌胶：小心、迅速地将混匀的胶灌到模具的框内。灌胶时胶液沿着上面有硅油的玻璃板的一端即文具夹的另一端，向文具夹方向推进，边灌胶边推上面的玻璃板，使模具框内充满胶液，框内不能有气泡，为赶走气泡可移动玻璃板，待气泡释放后再向前进，一直推到接触文具夹，使两块玻璃把胶封在框内，模具框内充满胶液，切不可有气泡，否则要重新制胶和灌胶（参看图20-3(b)）。
在正式灌胶之前调水平之后，以8ml水代替胶液练习灌胶，直到不产生气泡为止。操作熟练后，洗净玻璃板、模具、晾干备用。抽气后再加TEMED和过硫酸铵，混匀后迅速灌胶。过硫酸铵溶液要新鲜，必须当天配制。
（3）去掉上面的玻璃板和模具：灌胶后室温静止1h，在模具和胶的边缘可观察到折光，这是胶已凝固的特征。再老化0.5h，然后小心将两块玻璃打开，凝胶和模具会自然地贴附在其中一块玻璃板上，去掉上面的模具及凝胶板周围的和渗出边缘的残胶，即可作加样准备。

3．加样、电泳
（1）加样前准备
● 在电泳槽上涂一层液体石腊，再铺一张方格坐标纸（点样时作定位用）。用一塑料片刮去电泳槽与坐标纸之间的气泡，并使坐标纸浸透石腊。
● 将带胶的玻璃板放至涂有石腊的坐标纸上面，赶走气泡。
● 接通冷凝水，再调一次水平。
● 铺电极条：将1cm宽、9cm长的3层滤纸条浸透电极液（阳极用磷酸1mol·L^-1，阴极用氢氧化钠1mol·L^-1）后，放在另一张滤纸上吸干面上的电极液，用镊子将电极条铺在凝胶两端，轻压电极，使电极条和胶贴紧，一定要平直，多余部分剪去，胶面上的残液用滤纸吸净（参看图20-3（d））。
（2）加样
● 取8层擦镜纸重叠在一起，剪成约纸5×5mm小块，浸透样品，放在离电极1cm以外的胶面上。PI6以下的样品置于负极附近，pI6以上样品位于正极附近，贴紧。微量标准样品可少几层擦镜纸或直接加样在胶面上。根据玻璃板下坐标纸所显示的格子，自由选择待测样品和标准样品放置的部位。
● 压好电极板，盖好盖子，接通冷凝水，再调一次水平（参看图20-3（c））。

（3）电泳
● 开始：恒压60V，15min后，恒流8mA，电泳时电压不断上升，直到电压升为550V时，关电源。
● 开盖去掉加样纸，以免纸上残留的样品在染色时干扰结果的判断。
● 调节电源，恒压580V，继续电泳，至电流降为零（2—3h），电泳结束，关闭电源。
4．检测pH梯度，固定，染色，脱色，制干板
（1）pH梯度的检测
从胶板上顺电场方向切下一条胶条，并切成0.5cm等距离的小块，顺序放入小试管内，加入0.5ml重蒸水，浸泡10min。用pH试纸或微电极测定pH值，或以表面微电极直接测定pH梯度，并绘制PH—cm图谱。也可以用已知pI蛋白样品所在位置的距离与pI值绘图。
（2）固定染色
● 将凝胶取下，放入固定液中固定4h，或过夜（换一次固定液）。
● 去掉固定液，用脱色液漂洗一次。
● 将染色液倒入培养皿内，染色30min。
一定注意取胶时，先用固定液淋洗一下，使胶滑润，防止破裂，用固定液冲胶入培养皿，或将胶面向下，用小钢铲将胶铲下掉入培养皿内。
（3）脱色，保存
● 将染色液倒掉，加脱色液浸泡至基本无底色。
● 用保存液浸泡10min后，将胶板放在浸泡过保存液的二层玻璃纸之间，赶走气泡、下面垫块玻璃板，室温下自然干燥。
五、结果讨论和注意事项
1．对两性电解质的要求
两性电解质是等电聚焦的关键试剂，所以对两性电解质的质和量都要特别注意。两性电解质含量2—3%较适合。能形成好的pH梯度。载体两性电解质由多乙烯胺与丙烯酸进行加成反应生成的混合物，放置时间过长会长菌，分解变质，不能使用。
2．制胶注意的问题
（1）丙烯胺最好是重结晶的。
（2）过硫酸铵一定要新配制的（参看SDS电泳）。
（3）所有水要用重蒸水。
（4）制胶时，玻璃板和模板必须水平放置。
（5）模板要平直光滑，不然灌胶时易溅漏。
3．对样品的要求
（1）样品必须无盐，否则电泳时样品条带可能走歪，拖尾或根本不成条带。
（2）加样的量要适当，电泳后蛋白质条带才能清晰规整。
（3）加样方法可以多样，可用样纸加样；或把样品混在凝胶里；也可把样品直接点在不同位置。
4．防止烧胶
（1）平板等电聚焦电泳的胶很薄（0.6mm），当稳流在8mA时，电压可上升到550V以上，由于阴极飘移，造成局部电流过大，胶承受不了而被烧断。
（2）防止烧胶的办法：注意观察，稳流8mA，电压上升到550V时，立即关电源。用恒功率电泳仪，控制输出功率在指定范围。在一定功率范围内，改进冷却条件，使因电流产生的热量及时散去。
（3）如果胶被烧了，可在烧断的位置换上一条宽的电极条压过断缝或在电源电极条内侧加一电极条，以此补救。
5．胶板制作注意事项
固定液可使蛋白质变性，不再扩散，故一定要多换一次；在电泳后取胶、固定、染色直至制干板都必须仔细，防止胶被损坏。

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