| SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量（垂直板型电泳） | | 点击： 作者： 来源： 时间： 2007-04-09 本站论坛 |
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SDS-PAGE有连续体系及不连续体系两种，这两种体系有各自的样品溶解液及缓冲液，但加样方式，电泳过程及固定、染色与脱色方法完全相同。
三、器材与试剂：
1．器材：
①夹心式垂直板电泳槽，凝胶模（135×100×1.5mm）（北京六一仪器厂）
②直流稳压电源（电压300—600V，电流50—100mA）
③吸量管（1,5,10 ml） ④烧杯（25,50,100 ml）
⑤细长头的滴管 ⑥1ml注射器及6号长针头
⑦微量注射器（10μl或50μl） ⑧水泵或油泵
⑨真空干燥器 ⑩培养皿（直径120mm）
2．试剂：
（1）标准蛋白质
目前国内外均有厂商生产低分子量及高分子量标准蛋白质成套试剂盒，用于SDS-PAGE测定未知蛋白质分子量。
①高分子量标准蛋白试剂盒（Pharmacia公司产品，表中16-1）。
表16-1 5种标准蛋白质
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蛋白质名称 |
Mr |
来 源 |
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甲状腺球蛋白
铁蛋白
过氧化氢酶
乳酸脱氢酶
血清清蛋白 |
669 000
440 000
232 000
140 000
67 000 |
猪甲状腺
马 肺
牛 肝
牛 心
牛 血 清 | 同时按说明书要求处理
②低分子量标准蛋白试剂盒，中国科学院上海生物化学研究所东风生化试剂厂生产（表16-2）。
表16-2 5种标准蛋白质
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蛋白质名称 |
Mr |
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磷酸化酶B
牛血清蛋白
肌动蛋白
磷酸酐酶
烟草花叶病毒外壳蛋白 |
94 000
67 000
43 000
30 000
17 500 | 每种蛋白含量为40μg。用时加入200μl样品溶解，经处理后，上样10μl（2μg）就能显示出清晰的条带。
③自己配制低分子量或高分子量标准蛋白质混合试剂。如买不到标准蛋白试剂盒时，可参考常用的标准蛋白质及其分子量表。从中选择3—5种蛋白质，如马心细胞色素C（Mr12 500）、牛胰胰凝乳蛋白原A（Mr25 000）、猪胃胃蛋白酶（Mr35 000）、鸡卵卵清蛋白（Mr43 000）、牛血清白蛋白（Mr67 000）等蛋白质，按照每种蛋白0.5—1mg·ml-1样品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。
（2）连续体系SDS-PAGE有关试剂
①0.2mol·L-1pH7.2磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钠(AR)Na2HPO4·2H2O25.63g或Na2HPO4·12H2O51.58g，再称取磷酸二氢钠(AR)NaH2PO4·H2O7.73g或NaH2PO4·2H2O8.74g，溶于重蒸水中并定容到1000ml。
②样品溶解液：0.01mol·L-1pH7.2磷酸盐缓冲液，内含1%SDS、1%巯基乙醇、10%甘油或40%蔗糖及0.02%溴酚蓝。用来溶解标准蛋白质及待测固体蛋白质样品。配制方法如表16-3。
表16-3 连续体系样品溶解液配制
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