| SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量（垂直板型电泳） | | 点击： 作者： 来源： 时间： 2007-04-09 本站论坛 |
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2mg |
0.5ml |
10ml |
如样品为液体，则应用浓一倍的样品溶解液，然后等体积混合。
③凝胶贮液：称Acr 30g,Bis 0.8g，加重蒸水至100ml，过滤后置棕色瓶，4℃贮存可用1—2个月。
④凝胶缓冲液：称SDS 0.2g，加0.2mol·L-1 pH7.2磷酸盐缓冲液至100ml。4℃贮存，用前，稍加温使SDS溶解。
⑤1%TEMED：取TEMED1ml，加重蒸水至100ml，置棕色瓶内4℃贮存。
⑥10%过硫酸铵（AP）：称AP1g，加重蒸水至100ml，此液应每周新配，置棕色瓶内，4℃贮存。
⑦电极缓冲液（0.1%SDS，0.1mol·L-1 pH7.2磷酸盐缓冲液）：称SDS1g，加500ml0.2mol·L-1 pH7.2磷酸盐缓冲液，再用蒸馏水定容至1000ml。
⑧1%琼脂（糖）：称琼脂（糖）1g，加100ml上述电极缓冲液使其溶解，4℃贮存。
（3）不连续体系SDS-PAGE有关试剂
①10%（W/V）SDS溶液：称5gSDS，加重蒸水至50ml，微热使其溶解，置试剂瓶中，4℃贮存。SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。
②1%TEMED（V/V）：取1mLTEMED，加重蒸水至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。
③10%AP（W/V）：称AP1g，加重蒸水至10ml。最好临用前配制。
④样品溶解液：内含1%SDS，1%巯基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01mol·L-1 pH8.0 Tris-HCl缓冲液。
●先配制0.05mol·L-1 pH8.0 Tris-HCl缓冲液：称Tris 0.6g，加入50ml重蒸水，再中入约3ml 1mol·L-1 HCl，调pH至8.0，最后用重蒸水定容至100ml。
●按表16-4配制样品溶解液。
表16-4 不连续体系样品溶解液配制
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SDS |
巯基乙醇 |
溴酚蓝 |
蔗糖 |
0.05mol·L-1Tris-HCl |
加重蒸水至最后总体积为 |
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100mg |
0.1ml |
2mg |
4g |
2ml |
10ml |
*如样品为液体，则应用浓一倍的样品溶解液，然后等体积混合。
⑤凝胶贮液
●30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称Acr 30g及Bis 0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃贮存。
●10%浓缩胶贮液：称Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃贮存。
⑥凝胶缓冲液
●分离胶缓冲液（3.0mol·L-1 pH8.9 Tris-HCl缓冲液）：称Tris 36.3g，加少许重蒸水使其溶解，再加1mol·L-1 HCl约48ml，调pH至8.9，最后加重蒸水定容至100ml，4℃贮存。
●浓缩胶缓冲液（0.5mol·L-1 pH6.7 Tris-HCl缓冲液）：称Tris6.0g，加少许重蒸水使其溶解，再加1mol·L-1 HCl约48ml调pH至6.7。最后用重蒸水定容至100ml，4℃贮存。
⑦电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol·L-1 Tris—0.384 mol·L-1甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0，甘氨酸28.8g，加入SDS 1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。
⑧1%琼脂（糖）溶液：称琼脂（糖）1g，加电极缓冲液100ml，加热使其溶解，4℃贮存，备用。
（4）固定液
取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。
（5）染色液
称考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液250ml，过滤后应用。
（6）脱色液
冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml。
四、操作步骤：
（一）安装夹心式垂直板电泳槽
关心式垂直板电泳槽操作简单，不易渗漏，其装置如图16-4。这种电泳槽两侧为有机玻璃制成的电极槽，两个电极槽中间夹有一个凝胶模，该模由1个 形硅胶框、长与短玻璃板及样品槽模板（梳子）所组成（见图16-5）。电泳槽由上贮槽（白金电极在上或面对短玻璃板），下贮槽（白金电极在下或面对长玻璃板）和回纹状冷凝管组成。两个电极槽与凝胶模间靠贮液槽螺丝固定。各部间依下列顺序组装：
2、将长、短玻璃板分别插到 形硅橡框的凹形槽中。注意勿用手接触灌胶面的玻璃。
3、将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。
4、将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。
5、竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂（糖）。其目的是封住空隙，凝固后的琼脂（糖）中应避免有气泡。
（二）配胶及凝胶板的制备
1．配胶
根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。由于SDS-PAGE有连续系统及不连续系统两种，两者间有不同的缓冲系统，因而有不同的配制方法，见表16-5和表16-6。
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