2．考马斯亮蓝R250（Coomassie brilliant blue R250）。C
45H
44O
7H
3S
2Na，
MW=824， λ
max=560―590nm。染色灵敏度比氨基黑高5倍。尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。但蛋白质浓度超出一定范围时，对高浓度蛋白的染色不符合Beer定律，用作定量分析时要注意这点。
3．考马斯亮蓝G250，又名Xylene brilliant cyaninG。比考马斯亮蓝R250多二个甲基。
MW=854；λ
max=590―610nm。染色灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地染色蛋白而几乎无本底色。所以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于作定量分析。
4．1-苯胺基-8-萘磺酸（1-anilino-8-naphthalene sulfonic acid，简称ANS），本身无荧光，但与蛋白质结合后则产生荧光。电泳后，取出凝胶入在平皿中，用此染料溶液浸1—3分钟，用长波紫外灯照射时，产生黄色荧光。可显示蛋白质100微克，如果不明显，可将凝胶取出暴露于空气或盐酸气中，或浸没在3mol·L-1盐酸中几秒至2分钟，使表面蛋白质稍变性，然后再用ANS染色，这样可显示蛋白质20微克。
这样的染色优点是可保留凝胶内部的酶和抗体的活性。可将该区带切下来进行酶活力测定；也可直接把凝胶捣碎研细，用作抗原来注射动物，聚丙烯酰胺不影响抗体的产生。
聚丙烯酰胺盘状电泳具有使样品区带浓缩变窄的作用，所以分辨力高，在很多情况下超过超速离心和常用的层析及一般电泳技术；设备简单，样品量小（1—100微克）；时间短，操作方便，可分离物质的分子大小范围广泛，由多肽到核糖核蛋白体及病毒都可以分离，亦可改变为超微量测定（10
-9—10
-12克），并可结合SDS来测定蛋白质亚基分子量；或测定核酸等的分子量。这种方法现在几乎代替了超速离心沉降法。它还可以结合等电点聚焦电泳以提高分辨率。
聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳用途较广，对生物高分子化合物能进行分离、定性、定量分析，又能用于制备毫克水平的材料。
三、器材及试剂：
1．器材：
①血清以及其他蛋白质样品。
②圆盘电泳槽、稳压直流电源（500V）。
③玻璃管0.5×7―10cm（×1）及制胶架。
④日光灯。
⑤三角烧瓶。
⑥注射器10ml（×1）、长针头。
⑦滴管。
⑧培养皿￠10cm（×5）。
⑨吸管1ml（×1）、2ml（×1）、5ml（×1）、0.5ml（×1）。
⑩凝胶成像系统或光密度计。
2．试剂：
①丙烯酰胺（Acr）：分析纯。如不纯，可按下法重结晶：90g丙烯酰胺，溶于500ml50℃氯仿，热滤，滤液用盐冰浴降温，即有结晶析出。砂芯漏斗过滤，收集结晶。按同法再重结晶一次。结晶于室温中赶尽氯仿（约得50g左右，M.P84.3℃），贮棕色瓶中，干燥低温保存（4℃）。
②N，N＇-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）：分析纯。如不纯按下法处理：12g亚甲基双丙烯酰胺，溶于1000ml40—50℃丙酮。热滤，滤液慢慢冷至-20℃，结晶析出，砂芯漏斗吸滤，结晶用冷丙酮洗数次，真空干燥。贮棕色瓶，干燥低温（4℃）保存。
（注意：Acr和Bis都是神经毒剂，对皮肤有刺激作用，应在通风橱内操作。操作者需戴医用乳胶手套）
③N，N，N＇，N＇-四甲基乙二胺（简称TEMED）：密封保存。可用N-二甲基氨基丙腈或三乙醇胺代替，但效果较差。
④三羟甲基氨基甲烷（简称Tris）。
⑤核黄素：避光保存。光聚合催化剂。
⑥7%醋酸溶液（V/V）。
⑦0.5%氨基黑10B（C
22H
13O
12N
6S
3Na
3）溶液：用7%醋酸溶液配制。
⑧0.01%溴酚蓝溶液。
⑨蔗糖。
⑩PH8.4硼酸缓冲液（0.2mol·L-1硼酸盐）。
四、操作步骤：
1．贮备液的配制：按表15-2配制A、B、C、D、E、F各贮备液：
表15-2 贮备液配制
上述各贮备液都需冷藏（4℃）。尤其是C、D两贮液，由于Acr及Bis易水解生成丙烯酸和NH
3，冷藏也只能保存1—2月。如PH超过5.2，即失效。
2．凝胶的制备：
（1）将内径0.5cm的玻管切成7—10cm长，切口磨光，洗液浸泡后，水洗净烘干。
（2）分离胶的制备及预电泳：于一小三角烧瓶内，按A∶C∶H
2O∶E=1∶2∶4.6∶0.4（V/V）加入各贮液，摇匀，抽气（水泵或油泵）10分钟，将此胶液装入玻管2/3高度（玻管直立，下端插入制胶架凹横内凹槽内事先加入F液1—2滴）。表面覆盖少量蒸馏水，以隔绝空气并使胶面平整。用日光灯照射20分钟，刚加水覆盖时，可看出界面，后界面逐渐消失，聚合完成后，界面又重新出现，再静置30分钟使聚合完成。胶液凝聚后，用小滤纸条，小心吸去表面水分。
分离胶的预电泳（此步操作根据实验的需要决定取舍）：凝胶聚合程度一般在90%以上。残留的物质，尤其是过硫酸铵，对某些样品（如酶）会造成钝化或引起其它人为效应。因此有时需要在正式电泳前，先用电泳方法除去这些残留物，这步称为“预电泳”。若直接用光密度计来扫描分离的区带，则预电泳步骤更为必要，因未聚合的丙烯酰胺单体对紫外光有较高吸收，会干扰测定。
预电泳步骤：小心地拔出玻璃管，用滤纸吸干（不要直接接触胶面）后，用分离胶缓冲液（即不含TEMED的A液）洗涤一下。把玻璃管插入电泳装置中，塞紧橡皮塞上下电极槽中加入分离胶缓冲液，玻璃管下端不得有气泡，预电泳用3毫安/管，30分钟—2小时。
预电泳不能在制好浓缩胶后进行，也不能用电极缓冲液进行，不然会破坏不连续系统，而使浓缩效应失效。如不用预电泳也可采用加1—5%巯基乙醇或二巯基苏糖醇到缓冲液和样品中来抵消过硫酸铵的氧化作用。
预电泳后，凝胶管含少量缓冲液，并用液体石腊封住，在4℃可贮藏几天。取用时，用注射器吸去液体石腊。
（3）浓缩胶（又称成层胶）的制备：于一小三角烧瓶内按B∶D∶E∶H
2O=1∶2∶0.5∶4.5（V/V）比例加入各贮液，混合后，抽气，加到玻管中分离胶的上面，高度约1cm，表面覆盖一层水，然后距日光灯10cm处进行光照，正常情况下，照射几分钟后，则凝胶液由淡黄色变成乳白色，表明聚合开始，继续照射30分钟，使聚合完全。凝聚后吸去表面水分。浓缩胶层应临用前制备。
3．样品的准备
聚丙烯酰胺盘状电泳可用以分离各种蛋白质、核酸等样品。例如血清（参看图15-3）、唾液（参看图15-4）、细胞膜蛋白、动植物及微生物的各种蛋白提取液、昆虫的体液、各种酶制品及核糖核酸等。初学者可采用血清样品练习操作。
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