| 凝胶电泳常见问题分析 | | 点击： 作者： 来源：基因酷 时间： 2007-10-28 本站论坛 |
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内切酶酶切后应该产生300+74+25bp的3个片段，用琼脂糖凝胶电泳能不能跑得开？如果能，得用多少浓度？
参考见解：
1、 分是分的开的，只是不知道要不要看到这条带，如果只是对多个样本的分析的，那是完全没有问题的。用2.5~3.0%的胶跑过，不同样本间是肯定看的到的。当然，25BP这条带是看不到的。
2、 用10％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来进行电泳分离，可以分开的。不过缓冲液要用0.5的TBE，不要用TAE，其效果差些。下面是10ml的配方：
30％丙烯酰胺母液 3.3 ml
5 × TBE 1ml
10% A.P 70 ul
TEMED 5ul
120v 1.5h
在pH7.6的TBE缓冲液中进行质粒（DNA）的琼脂糖凝胶电泳时质粒向哪一极运动，为什么？如在DNA样品中加足够的亚精氨后再电泳会发生什么现象，为什么？
参考见解：
1、 DNA分子在碱性凝胶缓冲液中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。
2、 样品中加足够的亚精氨后,亚精胺头部的强阳极性使整个分子高度亲和于DNA，DNA与碱性亚精胺结合,结合分子带阳离子。
在琼脂糖电泳时0.5CM孔DNA上样量不宜超过500ng;可是当组分不同时可加20~30ug这是怎么回事?
参考见解：单个条带不超过500ng，如果有很多条带的话，总量500ng可能就会少了点，条带不清晰。
怎样根据目测条带亮度来判断DNA浓度？
参考见解：
1、 跑胶时候marker 可以加成定量marker，如1kb、100bp等marker，按说明书的量上样电泳，如加500ng量的DNA marker，电泳完毕后，就可将目的DNA条带和MARKER 条带的亮度做个大致的比较，找出两者最接近亮度的条带。因为marker的各条带都已知所含的DNA浓度（说明书中详细注明），因此根据条带的亮度、大小大致就可推测目的DNA的浓度。
2、 在通过目测DNA浓度的时候，最好要把加样量设一个梯度，比如从0。5、2、4、6，因为，如果质粒的量很浓的话，通过简单的对一条条带的目测产生的结果误差是很大的或者利用marker(推荐DL 2000),再用软件做半定量分析。
变性单链DNA在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率与什么有关？应该选用什么marker？marker上样时要变性吗？
参考见解：电泳迁移率(mobility)：如果把生物大分子的胶体溶液放在没有干扰的电场中，使带电颗粒具有恒定迁移率的驱动力来自于颗粒上的有效电荷Q和电位梯度E，即：
F = QE (1)带电颗粒在迁移中同时受到来自于介质的摩擦力F’，对于球形颗粒来说，在自由溶液中此阻力服从Stock定律：
F’ = 6π r η v (2)这里v是在介质粘度为η的溶液中，半径为r的带电颗粒的移动速度。但在凝胶中，这种阻力并不完全符合Stocks定律。F’还取决于介质中的其它因素如凝胶厚度、颗粒大小和介质的内渗等。
当带电颗粒达到稳态运动时，F=F’，由(1)、(2)式推导出：
v Q
——— = ———— （3）
E 6πr η
不同的带电颗粒在同一电场中运动速度不同，其泳动速度用迁移率（或称泳动度）m来表示，定义为在电位梯度E(V/cm)的影响下，颗粒在时间t中迁移距离d(cm)，即在单位电场强度(1 V/cm)时的泳动速度：
v d
m = —— = ——— (4)
E t·E
将(3)代入(4)，得到
Q
m = ———— (5)
6πr
由上式可看出电泳迁移率与球形分子、介质粘度、颗粒所带电荷有关。在确定的条件下，某物质的迁移率为常数，是该物质的物化特性常数。从(4)式可以导出迁移率的单位是cm2·s-1·V-1。
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