定量PCR的测定原理和方法-试验方案

定量PCR的测定原理和方法
点击： 作者：51protocol收集 来源： 日期：2007-06-02 本站论坛

尽管PCR目前在临床上的应用存在争议，由于试剂，设备以及人员素质等原因其结果也不尽如人意，但作为分子生物学基本技术之一，究其技术本身是成熟的。多年以来PCR技术只作为一种高灵敏的定性技术而被应用，既制约了PCR质量控制的建立，又大大制约了PCR技术的应用，近年来定量PCR的出现为PCR的应用开拓了广阔的前景。 原理：经典PCR一般分为扩增和检测两个阶段,常用溴乙锭染色,凝胶电泳为定性检测手段。由于定性实际上就是定量的一种粗约表现，因此只要对检测手段进行改进就可以实现精确定量。荧光标记技术是分子生物学最常用的标记技术，荧光染料或荧光标记物与扩增产物结合后，被激发的荧光强度和扩增产物成正比。而根据扩增原理，扩增是呈指数增长，因此在反应体系和反应条件完全一样下，样本含量应与扩增产物的对数成正比，故在一定的条件下荧光强度和样本含量成正比。

方法1：非特异性染料结合法利用某些荧光素能和双链DNA结合，结合后的产物具有强的荧光效应（如上图）。当扩增结束后，随温度的降低，DNA复性成为双链荧光素与之结合，经激发产生荧光，测定荧光强度，通过内标或外标法求出因数，可以准确定量。优点：简单易行，成本较低。缺点：荧光素的结合非特异，荧光素和引物二聚体等有结合，在低样本浓度时影响大，不能进行突变分析和双色分析。