大抽protocol(200ml)
1:4度,6000rpm,10min,离心菌。
2:4ml溶液1(见分子克隆)重悬。
3:8ml溶液2(0.2MNaOH,1%SDS)裂解,轻颠5-10次,室温10min。
4:4ml溶液3中和,轻颠5-10次,冰上15分钟。
5:4度,20000g,离心45min。
6:上清与0.6倍体积异丙醇混匀,室温10min,离心室温12000rpm,15min。
7:75%乙醇刷洗一遍,离心10min。
8:3ml水溶解充分(很重要)。
9:加入3ml冰预冷的5M Licl混匀,离心4度12000rpm,10min。
10:倒出上清加入等体积异丙醇充分混匀静放10min,离心室温12000rpm,10min。
11:75%乙醇刷洗一遍,离心10min,晾干(重要)。
12:500微升含RNAase(300微克/ml)溶解,37度放60min。
13:酚:氯仿(1:1)抽提一次,若不干净再抽一次(很重要)。
14:加入2倍体积无水乙醇再加入1/10体积乙酸钠充分混匀,室温沉淀15min,离心12000rpm,室温10min。
15:1ml水溶解沉淀(重要),再加入0.5mlPEG-Mgcl2混匀,室温静放20min,离心室温12000rpm,20min。
16:沉淀0.5ml75%乙醇洗两遍,4度离心20000g ,5min。
17:吸去乙醇晾干(重要)。
18:用100-500微升水溶解质粒,测OD值,然后分装。
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