| PCR自测题 | | 点击： 作者：51protocol收集 来源： 时间： 2007-06-02 本站论坛 |
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PCR自测题
一、名词解释
1、PCR: 即聚合酶链式反应。在模板，引物，4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异性地扩增位于两段已知序列之间的DNA区段地酶促合成反应。
2、变性：于PCR反应体系中，通过加热使温度至95℃左右，使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA作为反应模板。
3、退火： PCR反应中，经变性后将温度降至引物的TM值左右或以下，引物与DNA模板互补区域结合，形成杂交链的过程。
4、延伸：当反应体系温度升至70℃左右时，TaqDNA聚合酶催化以引物为起始点的5‘→3’延伸反应，形成新生DNA链。
5、逆转录PCR：以mRNA为原始模板进行的PCR反应。
6、停滞效应：PCR中后期，随着目的DNA扩展产物逐渐积累，酶的催化反应趋于饱和，DNA扩增产物的增加减慢，进入相对稳定状态，即为停滞效应，又称平台期。
7、共享引物PCR：利用3条引物扩增两种不同的DNA序列，其中一条引物与两种待扩增序列都互补，它与另两条引物分别组成两对PCR引物，此种PCR常用于细菌学鉴定，确定同一种属细菌的不同种类。
8、多重PCR：在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份DNA样品中不同序列的PCR过程。
9、反向PCR：利用连接酶将一段未知序列两端连接成环状，利用单一限制酶原点切开已知序列，据已知序列的碱基顺序设计3‘端和5’端引物扩增未知序列。
10、原位PCR：以组织固定处理细胞内的DNA或者RNA作为靶序列，进行PCR反应的过程，不必从组织细胞中分离模板DNA或RNA。
11、LCR：连接酶链反应，又称连接酶扩增反应，是以DNA连接酶将某一DNA链的5‘磷酸与另一相邻链的3’羟基连接为基础的循环反应, 特点是能准确分析基因序列中的单个碱基突变。
1、简述PCR反应的基本步骤。
PCR反应的基本步骤包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。
（1）变性（denaturation）：加热使双链DNA变为单链;
（2）退火（annealing）：当温度降至引物的Tm值左右或以下，引物与DNA模板互补区结合，形成杂交链，这一过程称退火。当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系中引物DNA的分子数大大超过模板DNA的分子数，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少；
（3）延伸（extension）：耐热DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物为起始点的延伸反应。
2、简述PCR模板的种类及制备方法。
DNA和RNA均可作为PCR的模板。
DNA可以直接作模板加入反应体系进行扩增，RNA的扩增需要逆转录为cDNA后才能进行PCR扩增，故又称这种扩增方式为RT-PCR。DNA模板的制备通常采用去垢剂破坏细胞，除杂质，乙醇沉淀核酸或水煮沸溶解细胞。
RNA模板的制备可采用RNA提取试剂盒、酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法、异硫胍氯化铯密度梯度分离法、SDS-酚-氯仿法。制备RNA模板时，要注意防止RNA水解。
3、简述PCR产物的积累规律。
PCR产物的积累规律：PCR反应过程遵循酶促动力学规律。在反应初期，反应产物以指数方式累积。随着反应的进行，体系中的各成分的比例发生变化，扩增速度逐渐放慢。反应后期，酶的催化反应趋于饱和，反应曲线出现拐点而进入反应的“平台期”。
达到平台期所需的PCR循环次数取决于反应体系中模板的拷贝数、PCR扩增效率、DNA聚合酶的种类和活性、引物质量、以及非特异性扩增条带的竞争等诸多因素。
4、简述PCR的基本反应。
（1）以DNA为模板的反应：反应体系一般选用50～100μl体积；其中含有缓冲液、MgCl、明胶或牛血清白蛋白、引物、4种dNTP、模板DNA、TaqDNA聚合酶。封上矿物油防止高温反应时液体的挥发，即可进行PCR反应。
（2）以mRNA为模板的反应：以mRNA为原始模板进行的PCR反应称为逆转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)。首先将mRNA逆转录生成cDNA，然后再进行PCR反应。逆转录反应体系一般选用20μl体积，其中含有RNA酶抑制剂、缓冲液、４种dNTP、MgCl2、DTT、牛血清白蛋白、oligo(dT)12-18引物，RNA模板、逆转录酶。逆转录反应在42℃进行，随后将反应混合物加热在95℃，5分钟，灭活逆转录酶。取2μl反应产物，按DNA为模板的PCR反应步骤、进行扩增反应。
5、简述PCR实验应注意的事项。
由于PCR反应极强的扩增能力和检测的灵敏性，微量样品污染便有可能导致假阳性结果的出现。为此在实验操作中应谨防污染的发生，并设置严格的对照，以提高PCR结果的正确性。在有条件的情况下，PCR实验室应设.样品制备区、PCR操作区及反应产物分析区；在进行PCR反应时，应设阳性对照、阴性对照和试剂对照；扩增反应总是阴性结果（无产物）时应采取的措施：⑴取10
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