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蛋白质分子量测定：凝胶过滤层析法

点击： 作者：51protocol收集 来源： 时间： 2007-06-02 　本站论坛

蛋白质分子量测定：凝胶过滤层析法

一、目的：
（1）初步掌握利用凝胶层析法测定蛋白质分子量的原理。
（2）学习用标准蛋白质混合液制作Ve，Kav对1gMr的“选择曲线”以及测定未知蛋白质样品分子量的方法。
二、原理：
凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又叫做分子筛层析法（molecular sieve chromatography），排阻层析法（exclusion chromatography）。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。分离过程中的示意见图17-1。
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose），人工合成凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel-P）和葡聚糖（dextran）凝胶，后者的商品名称为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶，它是个有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水，其化学结构式如图17-2所示。
这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。
为了说明凝胶层析的原理，将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt（total volume）表示。实际上Vt是由Vo，Vi与Vg三部分组成，即：
Vt=Vo Vi Vg
Vo称为“孔隙体积”或“外体积”（outer volume）又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体
积（inner volume），又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，相应于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得；Vg为凝胶本身的体积，因此Vt—Vo等于Vi Vg 。它们之间的关系可用图17-3表示。

洗脱体积（Ve，elution Volume）与Vo及Vi之间的关系可用下式表示：
Ve=Vo KdVi
式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。

它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可改写成：

上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液（最好有颜色以便于观察，如血红蛋白，印度黑墨水，分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000等）通过实际测量求出；Vi可由g·WR求得（g为干凝胶重，单位为克；WR为凝胶的“吸水量”，以毫升/克表示）。因此，对一层析柱凝胶床来说，只要通过实验得知某一物质的洗脱体积Ve，就可算出它的Kd值。以上关系可用图17-4表示。

Kd可以有下列几种情况：
有颜色以便于观察，如血红蛋白，印度黑墨水，分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000等）通过实际测量求出；Vi可由g·WR求得（g为干凝胶重，单位为克；WR为凝胶的“吸水量”，以毫升/克表示）。因此，对一层析柱凝胶床来说，只要通过实验得知某一物质的洗脱体积Ve，就可算出它的Kd值。以上关系可用图17-4表示。
Kd可以有下列几种情况：
1、当Kd=0时，则Ve=Vo。即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质（全排阻），洗脱体积等于空隙体积（图中组分Ⅰ）。
2、当Kd=1时，Ve=Vo Vi。即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内体积之和（图中组分Ⅲ）。
可以看出，对某一凝胶介质，两种全排出的分子即Kd都等于零，虽然分子大小有差别，但不能有分离效果。同样两种分子如都能进入内部空隙，即Kd都等于1，它们既使分子大小有不同，也没有分离效果。因此不同型号的凝胶介质，有它一定的使用范围。
3、当0＜Kd＜1时，Ve=Vo KdVi。表示内体积只有一部分可被组分利用，扩散渗入，Ve即在Vo Vi之间变化（图中组分Ⅱ）。

4、有时Kd＞1，表示凝胶对组分有吸附作用，此时Ve＞Vo Vi。例如一些芳香族化合物的洗脱体积远超出理论计算的最大值，这些化合物的Kd＞1。如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸在Sephadex G-25中的Kd值分别为1.2，1.4和2.2。

在实际工作中，对小分子物质也得不到Kd=1的数值，特别是交联度大的凝胶差别更大，如用G-10型得Kd值0.75左右，用G-25型得0.8左右。这是由于一部分水相与凝胶结合较牢固，成为凝胶本身的一部分，因而不起作用，小分子不能扩散入内所致。此时Vi即不能以g·WR计算，为此也常有直接用小分子物质D2O，NaCl等通过凝胶柱而由实验计算出Vi值的。另一个解决的办法是不使用Vi与Kd，而用Kav（有效分配系数）代替Kd，其定义如下：
已知

在这里实际上将原来以水作为固定相（Vi）改为水与凝胶颗粒（Vi—Vo）作为固定相，而洗脱剂（Ve—Vo）作为流动相。Kav与Kd对交联度小的凝胶差别较小，而对交联度大的凝胶差别大。
在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相流过Vt体积后，所有的组分都应该被洗出来，这一点为凝胶层析法的特点，与一般层析方法不同。
Ve与分子量的关系：对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前面。Ve与分子量的关系可用下式表示：
V e=K1—K2logMr
K1与K2为常数，Mr为分子量，Ve也可用Ve—Vo（分离体积），Ve/Vo（相对保留体积），Ve/Vt（简化的洗脱体积，它受柱的填充情况的影响较小）或Kav代替，与分子量的关系同上式，只是常数不同。通常多以Kav对分子量的对数作图得一曲线，称为“选择曲线”，如图17-5所示。曲线的斜率是说明凝胶性质的一个很重要的特征。在允许的工作范围内，曲线愈陡，则分级愈好，而工作范围愈窄。凝胶层析主要决定于溶质分子的大小，每一类型的化合物如球蛋白类，右旋糖酐类等都有它自己的特殊的选择曲线，可用以测定未知物的分子量，测定时以使用曲线的直线部分为宜。
用凝胶层析法测定蛋白质的分子量，方法简单，技术易掌握，样品用量少，而且有时不需要纯物质，用一粗制品即可。例如在一粗酶制剂中，为了测定某一酶组分的分子量，只要测定洗脱液中具有该酶最大活性的部分，然后确定其洗脱体积，即可从标准曲线中查出其分子量。

凝胶层析法测定分子量也有一定的局限性，在pH6—8的范围内，线性关系比较好，但在极端pH时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。糖蛋白在含糖量超过5%时，测得分子量比真实的要大，铁蛋白则与此相反，测得的分子量比真实的要小。

有一些酶底物是糖，如淀粉酶，溶菌酶等会与葡聚糖凝胶形成络合物，这种络合物与酶-底物络合物相似，因此在葡聚糖凝胶上层析时表现异常。用凝胶层析法所测分子量的结果，要和其它方法的测定相对照，由此才可作出较可靠的结论。

凝胶层析技术操作方便，设备简单，周期短，重复性能好，而且条件温和，一般不引起生物活性物质的变化，目前已得到相当广泛的应用，例如可用于脱盐，浓缩高分子物质的溶液，生化物质的分离提纯，去除热源物质以及用于测定高分子物质的分子量。下面实验是用葡聚糖凝胶层析法测定蛋白质的分子量。

三、试剂及器材：
1、试剂：
（1）标准蛋白质混合液（各2—3mg·ml-1，用氯化钾-乙酸溶液配制），牛血清清蛋白（Mr67000），鸡卵清蛋白（Mr43000），胰凝乳蛋白酶原A（Mr25000）和结晶牛胰岛素（PH2时为二聚体Mr12000）等均需层析纯。
（2）蓝色葡聚糖-2000（8—10mg·ml-1），N-乙酰酪氨酸乙酯（或硫酸铵或重铬酸钾）（8—10mg·ml-1）。
（3）0.025mo·L-1氯化钾-0.2mol·L-1乙酸溶液，Sephadex G—75（或G—100），5海ˋc）2。
（4）待测蛋白质样品液。
2．器材：
层析柱：柱管（直径1.0~1.3cm；管长90~100cm），核酸蛋白检测仪或紫外分光光度计，自动部分收集器，恒压瓶，下口瓶。
四、操作步骤：
1、一般操作方法：
（1）凝胶的选择和处理
凝胶颗粒最好大小比较均匀，这样，流速稳定，结果较好。如果颗粒大小不匀，用倾泻法倾去不易沉下的较细颗粒。
将称好的干粉倾入过量的洗脱液（一般多用水，盐溶液或缓冲溶液）中，室温下放置，使之充分溶胀。注意不要过分搅抖，以防颗粒破碎。溶胀时间因凝胶交联度不同而异为了缩短溶胀时间，可在沸水浴上加热将近100℃，这样可大大缩短溶胀时间至几小时，而且还可以杀死细菌和霉菌，并可排除凝胶内气泡。种类凝胶溶胀时间请查阅葡聚糖凝胶的技术数据表。
（2）装柱
装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气。装柱方法与一般柱层析法相似。层析柱可以自制或外购，目前已有各种规格层析柱商品（图17-6）。

装柱前须将凝胶上面过多的溶液倾出。关闭层析柱出水口，并向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，然后在搅拌下，将浓浆状的凝胶连续地倾入柱中，使之自然沉降，待凝胶沉降约2—3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。接着再通过2—3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保持凝胶上端有一段液体。

新装好的柱要检验其均一性，可用带色的高分子物质如蓝色葡聚糖-2000（又称蓝色右旋糖，商品名为Blue dextran-2000）、红色葡聚糖或细胞色素C等配成2mg/ml的溶液过柱，看色带是否均匀下降，或将柱管向光照方向用眼睛观察，看是否均匀，有无“纹路”或气泡。若层析柱床不均一，必须重新装柱。
（3）加样
要照顾到浓度与粘度两个方面。分析用量：1—2ml/100ml柱床容积（1—2%）；制备用量：20—30ml/100ml柱床容积。
加样方法与一般柱层析相同。夹紧上、下进、出水口夹子，为防止操作压改变，可将塑料管下口抬高至离柱上端约50cm处（Sephadex G-75，选用50cm液柱操作压），打开柱上端的塞子或螺丝帽，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切。沿管壁将样品溶液小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起，打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时,夹紧下口夹子。按加样操作，用1ml洗脱液冲洗管壁2次。最后加入3—4ml洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒压瓶，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连（如图17-7）。

（4）洗脱

洗脱液应与凝胶溶胀所用液体相同。洗脱用的液体有水（多用于分离不带电荷的中性物质）及电解质溶液（用于分离带电基团的样品），如酸、碱、盐的溶液及缓冲液等。对于吸附较强的组分，也有使用水与有机溶剂的混合液，如水-甲醇、水—乙醇、水-丙酮等为洗脱剂，可以减少吸附，将组分洗下。本实验洗脱用0.025mol·L-1氯化钾-0.2mol·L-1乙酸溶液。
洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.025mol·L-1氯化钾-0.2mol·L-1乙酸溶液，以每管3ml/10min流速洗脱，用自动部分收集器收集流出液。
影响洗脱液流速的因素有：
①洗脱液加在柱上的压力——操作压（由液面差引起）。一般来说，流速与柱压力差成正比，但对某些种类凝胶加压不能超过一个极限值，否则加大压力，不仅不能增加流速，反而使流速急剧下降，特别是在使用交联度小（WR＞7.5）的凝胶时要特别注意。为保持层析过程中恒定的压力，可使用恒压瓶。
②凝胶交联度；交联度大的凝胶（G-10至G-50型）的流速与柱的压力差成正比，与柱长成反比，与柱的直径无关。交联度小的凝胶（G-75 至G-200型）的流速与柱的直径有关，并在一定操作压差下有最大的流速值，操作压见图17-8。
③凝胶颗粒大小：颗粒大时，流速较大，但流速大时洗脱峰形常较宽。颗粒小时，流速较慢，分离情况较好。要求在不影响分离效果情况下，尽可能使流速不致太慢，以免用时过长。

（5）重装
一般地说，一次装柱后，可反复使用，无特殊的“再生”处理，只须在每次层析后用3—4倍柱床体积的洗脱液过柱。由于使用过程中，颗粒可能逐步沉积压紧，流速逐渐会减低，使得一次分析用时过多，这时需要将凝胶倒出，重新填装；或用反冲方法，使凝胶松动冲起，再行沉降。有时流速改变是由于凝胶顶部有杂质集聚，则需竟混有脏物的凝胶取出，必要时可将上部凝胶搅松后补充部分新胶，经沉集、平衡后即可使用。
（6）凝胶的保存方法
凝胶用完后，可用以下方法保存。
①膨胀状态：即在水相中保存。可按注意事项（9），加入防腐剂或加热灭菌后于低温保存。
②半收缩状态：用完后用水洗净，然后再用60%—70%乙醇洗，则凝胶体积缩小，于低温保存。
③干燥状态：用水洗净后，加入含乙醇的水洗，并逐渐加大含醇量，最后用95%乙醇洗，则凝胶脱水收缩，再用乙醚洗去乙醇，抽滤至干，于60—80℃干燥后保存。这3种方法中，以干燥状态保存为最好。
2．蛋白质分子量测定
根据待测蛋白质的分子量范围选用Sephadex G-75或G-100型凝胶，其颗粒在40—120μm，柱管选用直径1.0—1.3cm，柱长90—100cm，本实验选用1.1×100cm商品层析柱。
（1）测定Vo和Vi
将0.5ml蓝色葡聚糖-2000和硫酸铵混合液（2mg·ml-1）上柱、洗脱，分别测出Ve。蓝色葡聚糖的Ve即为该柱的Vo，硫酸铵洗脱体积Ve减去Vo即为柱的Vi。蓝色葡聚糖的洗脱峰可根据颜色判断，硫酸铵洗脱峰用Ba（Ac）2生成沉淀判断（若用重铬酸钾，其洗脱峰，可根据颜色判断）。
（2）标准曲线的制作

按上述方法将1ml标准蛋白质混合液上柱，然后用0.025mol·L-1氯化钾-0.2mol·L-1乙酸溶液洗脱。流速3ml/10min，3ml/管。用部分收集器收集，核酸蛋白质检测仪280nm处检测，记录洗脱曲线，或收集后用紫外分光光度计280nm处测定每管光吸收值。以管号（或洗脱体积）为横坐标，光吸收值为纵坐标作出洗脱曲线。

根据洗脱峰位置，量出每种蛋白质的洗脱体积（Ve）。然后，以蛋白质分子量的对数1gMr为纵坐标，Ve为横坐标,作出标准曲线（图17-9）。为了结果可靠，应以同样条件重复1—2次，取Ve的平均值作图。同时根据已测出的Vo和Vi以及通过测量柱的直径和凝胶柱床高度，计算出的Vt，分别求出Kd和Kav。
也可以Kd或Kav为横坐标，1gMr为纵坐标作出标准曲线。
（3）未知样品分子量的测定
完全按照标准曲线的条件操作。
五、结果与讨论：
根据紫外检测的洗脱峰位置，量出洗脱体积，重复测定1—2次，取其平均值，也可以计算出Kav，分别由标准曲线查得样品的分子量。

注意事项
（1）根据层析柱的容积和所选用的凝胶溶胀后柱床容积，计算所需凝胶干粉的重量，以将用作洗脱剂的溶液使其充分溶胀。
（2）层析柱粗细必须均匀，柱管大小可根据实际需要选择。一般来说，细长的柱分离效果较好。若样品量多，最好选用内径较粗的柱，但此时分离效果稍差。柱管内径太小时，会发生“管壁效应”，即柱管中心部分的组分移动慢，而管壁周围的移动快。柱越长，分离效果越好，但柱过长，实验时间长，样品稀释度大，分离效果反而不好。
用于脱盐的柱一般都是短而粗，柱长（L）/直径（D）＜10；对分级分离用的柱，L/D值可以比较大，对很难分离的组分可以达到L/D=100，一般选用内径为1cm，柱长100cm就够了。
（3）各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，应仔细检查并加以纠正。
（4）装柱要均匀，不过松也不过紧，最好也在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此而压紧凝胶。但也不宜过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降。
（5）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。
（6）样品溶液的浓度和粘度要合适。浓度大，自然粘度增加。一个粘度很大的样品上柱后，样品分子因运动受限制，影响进出凝胶孔隙，洗脱峰形显得宽而矮，有些可分离的组分也因此重叠。
（7）洗脱用的液体应与凝胶溶胀所用液体相同，否则，由于更换溶剂引起凝胶容积变化，从而影响分离效果。
（8）操作压过大可使流速变慢，此外还可以导致凝胶胶面下降，柱床容积的改变，相应测出Vt，Vo，Ve等也改变，造成实验结果的误差。
（9）由于葡聚糖凝胶为糖类化合物，并且一定要在液相中操作，所以有必要注意防止发霉与生长细菌。一般可用0.02%的叠氮钠（NaN3）溶液，它极易溶于水，不与蛋白质和糖反应，也不改变它们的层析效果，也可用0.002%的洗必泰（hibitane）溶液。在弱酸性溶液中，可用0.05%（或0.01%—0.02%）三氯丁醇溶液，但它在强碱性溶液或加热到60℃以上时就要分解。在弱碱性溶液中也可用0.01%乙酸汞溶液防腐消毒。一般不用氯仿、丁醇、甲苯等为防腐剂。因为它们能引起凝胶颗粒的收缩，同时还能进入层析仪器的塑料部件，使塑料变软，造成不良后果。
（10）使用部分收集器时，将其转盘调节到最外圈，从第一管开始，否则会造成转换臂的转动与转盘不同心，以致洗脱液流到管外。
凝胶层析中常遇到的故障之原因与排除方法总结见表17-1。

故障
产生的原因
排出的方法

恒压瓶不能恒压
1．恒压瓶上口或下口橡胶塞未塞紧或橡胶塞插玻璃管处漏气
1．找出漏气原因，塞紧橡胶塞

层析柱连接后，进水口无液体滴出
2．层析柱进水口或出水口的止水夹未打开

3．进水口塑料管中有气泡
2．打开止水夹

3．排除塑料管中的气泡

层析柱出水口无液体流出
4．出水口的止水夹未打开

5．层析柱下口螺丝未旋紧，因漏气而造成出水塑料管中有气泡

6．出水口塑料管被凝胶阻塞
4．打开出水口止水夹并调节流速

5．找出产生气泡的原因，排除气泡

6．将层析柱中的凝胶倒出，冲洗尼龙网排除塑料管中的凝胶，重新装柱

层析过程中流速逐渐减慢
7．样品中或洗脱缓冲液中含有不溶颗粒将胶床表面阻塞

8．操作压过高，将凝胶胶床压紧

9．测定内水时硫酸铵浓度太大；凝胶脱水使胶床压紧

10．加样时未注意恒压，加样后胶床床面下降

11．长期使用，微生物生长

12．装柱时凝胶未完全溶胀，平衡时流速即逐渐减慢

13．凝胶颗粒过细，或由于用暴力搅动凝胶使凝胶颗粒打碎
7．采用离心或过滤法除去不溶颗粒，用滴管移去柱床表面1—2cm的凝胶，补加新凝胶至同样高度

8．重新装柱，采用适当的操作压

9．将凝胶取出用缓冲液反复洗涤，溶胀重新装柱。适当降低硫酸铵浓度

10．加样时应根据操作压，将塑料管下水口抬高至相应的操作压

11．层析柱不用时，在平衡缓冲液中加入0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰，并使其充满柱床体积，以抑制细菌生长，暂时不用的柱应定期用缓冲液过柱冲洗，也可以防止微生物生长

12．将凝胶取出，待其完全溶胀后重新装柱

13．取出层析柱中的凝胶，用漂浮法除去过细的颗粒，重新装柱，搅拌凝胶应防止暴力

层析柱胶床中有气泡
14．装柱前，凝胶未抽气或煮沸，在凝胶中混入空气

15．加样不当使空气进入凝胶胶床

16．从冰箱中取出凝胶或凝胶缓冲液立即装柱，或装柱后被太阳暴晒
14．在凝胶柱上层的气泡可用细头长滴管或细塑料管将气泡取出或赶走，并重新平衡，稳定胶床后再使用，若气泡太多则应抽气或煮沸后自然冷却后装柱

15．小心加样防止带进气泡

16．凝胶或缓冲液应放置到室温后才能装柱，避免太阳直射

层析柱胶床破裂
17．大量空气进入层析柱

18．进水口流速慢，出水口流速快
17．找出空气进入层析柱的原因，重新装柱

18．找出进出水口流速不一致的原因，重新装柱

故障
产生的原因
排队的方法

样品进入凝胶后条带扭曲
19．样品或缓冲液中有颗粒或不溶物

20．凝胶表面不平，或胶床不均匀
19．按方法7处理样品或缓冲液

20．将凝胶柱置于垂直位，轻轻搅动胶床表面1—2cm处的凝胶，使其自然沉降

凝胶层析分辨率不高
21．凝胶层析柱装得不均匀

22．凝胶G型选择不当

23．加样量太大

24．柱床太短

25．样品浓度高，粘度大而形成拖尾

26．洗脱时流速太快

27．分部收集时每管体积过大
21．将凝胶取出重新装柱

22．根据欲分离物质分离的情况，选择合适的凝胶G型与粒度

23．为提高分辨率，分析时加样量一般为柱长的1—2%，最多不能超过5%

24．将柱床高度适当加长

25．根据紫外测定的光吸收值将样品适当稀释

26．调节洗脱的流速，（本实验为3ml/10min）

27．控制每管收集量，为便于紫外测定，每管收集量以2.8—3ml为宜

分部收集时，收集盘转动一次间隔数只试管或滴管口偏离相应的试管
28．使用前未经定位或开始收集后随便移动转换臂，从而造成收集盘与转换臂转动不同步
28．将自动收集器换向开关拨向“顺”，连续按手动开关，使收集盘与转换臂同时以“顺”时针方向转至外圈零位。将换向开关拨至“逆”，使转换臂的滴管口对准第一个试管中心，打开自动开关即可进行同步收集

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