细胞内钙测定方法

细胞内钙测定方法

细胞内钙测定方法

氟中毒大鼠动物模型

细胞内钙测定

细胞悬液制备：

将新鲜组织放于含1.3mM/LCaCl₂的冷Hanke’s液（0-4℃）中，冲洗2-3次，以剪刀将组织剪至碎块，置于1.3mM/LCaCl₂的冷Hanke’s液，以毛玻璃轻轻研磨，通过200目筛网吸取悬液，1000rpm/5min，加红细胞裂解液5-10min, 1000rpm/5min，用含1.3mM/LCaCl₂Hanke’s洗2次，去除细胞碎片。台盘蓝排斥试验查细胞存活率在95%以上，用0.2%牛血清白蛋白的Hank’s液调细胞数为2×10⁶/ml。将该细胞悬液37℃预温10min ，加入Fura-2/AM（终浓度为2-5ug/ml），37℃恒温震荡45min,负载后细胞以含0.2%牛血清白蛋白的Hank’s液洗2次，用Hank’s液调细胞数为1×10⁶，测定前37℃复温5-10min。

所需试剂

Fura-2/AM,200人份，以1ml二甲亚砜无菌条件下稀释，-20℃贮存。

Hank’s液

红细胞裂解液

0.2% 牛血清白蛋白Hank’s液

0.5mM Egta,pH 8.5

TritonX-100

荧光测定

测定原理：

Fura-2有两种形式：Fura-2/AM(acetoxymethyl ester,AM)和游离酸Fura-2。Fura-2因有较强的亲水性，难以进入细胞，只有将其做成亲酯的乙酰羟甲基酯，即Fura-2/AM后方可通过细胞膜，随后被胞浆的非特异性酯酶水解，生成 Fura-2，后者与胞浆游离Ca² 有高亲和力，与之结合形成Fura-2- Ca² 复合物。后者的激发光谱高峰分别为380nm和340nm，分别较Fura-2的荧光强度大大增强，并且激发波长从380nm移至340nm。相应于380nm处荧光侧减弱，而340nm处荧光增强。这种荧光比值变化的Ca² 依赖性成为敏感的定量测定Ca² 浓度的荧光比值技术的基础。Ca² 浓度在10^-5～10^-3umol/L时，其荧光发射强度与[Ca² ]_I之间存在一定函数关系。通过测定指示剂负载的细胞荧光强度便可测定[Ca² ]_i.理论上，将细胞彻底冲洗以去除细胞外染料和校正细胞的自动荧光后，负载有染料(dyeoades)的细胞的荧光光谱能细胞浆Ca² 浓度。Ca² 与荧光染料的解离常数Kd与细胞内Ca² 浓度的荧光强度水平由多种因素决定。包括染料内产生的荧光的量、细胞悬液中细胞的浓度、Ca² 指示剂在胞浆中的浓度和细胞的自动荧光等。

测定条件：

激发光栅5nm,发射光栅10nm，发射光波长500nm，以300-450扫描激发光谱。如果Fura-2/AM已经进入细胞，经酯酶水解成Fura-2并与Ca² ,则峰值为340nm,测定340nm处的荧光强度，加TritonX-100 5ul(终浓度为0.25%),Fura-2从细胞内到细胞外，与细胞外液中的钙结合,细胞外液中的钙比细胞内液中的钙高数倍，因此可见340nm处峰值明显升高此为最大值Fmax,然后加入0.5mM EGTA16ul(终浓度为4uM/L,pH 8.5)，螯和钙后，可见Fura-2激发峰值移至380nm，则峰值变小，此为最小值Fmin。

计算公式：

[Ca² ]_i =Kd

F-Fmin

Fmax-F