cDNA文库综合分析体系的建立

实验室的需求
·生物学实验室研究产生大量的EST/cDNA序列，如何分析数据成为现实问题。应用人工上网用blast比对分析1000个EST，约需2个月的工作量，且结果单一，数据不可靠。
·分析体系处理仅需1-2个小时，并且可以得到深入的分析结果，数据准确可靠。
·分析体系的完善需求
目前已经实现过相应的系统， 我们在分析思路的设计方面进行了改进并实现了多功能综合分析，本体系尤其适合对抑制性削减杂交(SSH)文库进行分析。
Outline :
·序列格式化，包括去除载体，屏蔽简单重复序列，计算核酸组成及长度，以Fasta格式输出
·比对Reference mRNA序列及Unigene序列，找出已知基因，并进行聚类分析
·对新基因序列进一步与人类染色体比对，筛选出可靠的新基因序列，排除错误序列
·新EST序列延伸，全长cDNA序列电子克隆及功能结构域分析
·点突变或者SNP分析
·制作基因表达图谱
Procedure:

Mask Vector and Format

通过格式化可去除测序过程中载体、重复序列的污染，计算有效序列长度并排除长度小于20bp的序列以提高分析效率
屏蔽载体序列、引物序列和重复序列的干扰，识别克隆目的序列去
除有效序列长度低于20bp的EST以提高工作效率
输出结果以自定义的fasta格式，以方便以后的分析

Blast to Reference mRNA DB

通过FTP在NCBI站点下载reference mRNA 数据，在本地使用‘formatdb‘命令进行格式化
使用-e 1E-10 参数控制blast结果

Screened Known Genes

Cluster ESTs by Gene

Cluster ESTs by Gene
对不同文库间表达基因进行聚类分析可以:
揭示文库间mRNA表达差异
得出相关组织共同表达的基因
提示不同来源的组织作为研究材料是否可相互替代

Point Mutation/SNP Analysis
Point Mutation
SNP Analysis
Further Analysis
From SNP to Haplotype

Map to Human Genome

Gene Expression Map

Reference DB None-hit EST

Blast to Human EST DB


Blast to Human Genome

Blast Parameters:
通过BLAST程序查找同源基因是对cDNA文库分析的一个主要手段，而控制blast结果的主要参数为E-value
BLAST程序算法中运用了Karlin-Altschul统计学理论，E-value即相当于统计学中的P值，该值越低则blast结果的显著性越高，因而检出序列越少
E-value对blast结果的影响与比对的数据库大小有关，使用相同的E-value对同一序列进行blast，在大一些的数据库中得到的结果相似性低于小一些的数据库
一般认为，所比对序列中每100bp有96％以上同源，则认为该序列为同源序列
这个百分比标准随着序列长度的增加可适度降低

Innovation:
生物学家常见的思维是通过比对NR的DNA数据库，但这种比对有很大缺点:
一、NR中包括各种动物的DNA信息
二、NR太大，查询及比对耗时太多
三、结果不好

应当使用Reference mRNA Human EST
这个分类清晰
有专门的HUMAN DNA 文库
通过BLAST程序查找同源基因

Perspective:
应用该系统可以解决cDNA文库数据系统、高效的高通量分析。
该分析体系经过进一步完善，构建成为一个cDNA文库的综合分析平台，可以为生物学家提供一个可靠、易用、高效、操作简便的分析工具。
该体系的建立和完善有助于其他相关综合分析体系的构建。