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cDNA的合成

点击： 作者：51protocol收集 来源： 时间： 2007-08-17 　本站论坛

一原理
逆转录PCR (RT-PCR) 具有灵敏度高、专一性好、简便快捷等优点，其不仅是定量检测微量样品和表达水平低的基因的一种有效方法，同时也是从真核生物中获得目的基因的一条重要途径。
cDNA的合成是RT-PCR的重要环节。以mRNA为模板，在逆转录酶的催化下，随机引物、oligo(dT)或基因特异性引物的引导下合成互补的DNA（complementary DNA，cDNA），再按照普通PCR的方法用两条引物以cDNA为模板，则可扩增出不含内含子的可编码完整基因的序列。
不同mRNA拷贝成cDNA的效率不同；因此，适合于一种mRNA拷贝的条件可能对另一种mRNA不适合。一般来说，从事不均一mRMA群体时，所使用的条件是导致cDNA合成的终产量达到最大，下述参数十分重要。
1．逆转录酶有两种不同的逆转录酶可以催化以mRNA为模板，oligo(dT)作为引物，合成与mRNA互补的cDNA链。一种来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒（AMV），由两条肽链组成，具有聚合酶活性和很强的RNA酶H活性，它最适温度是42℃，最适pH8.3。在高反应温度时可消除mRNA的二级结构对逆转录的阻碍，然而高水平的RNA酶H的活性既抑制cDNA产生也限制其长度。另外，禽源逆转录酶制剂可被能切割DNA的核酸内切酶污染。另一种来源于鼠白血病病毒（Mo-MLV），是单肽链的，有RNA聚合酶活性和相对较弱的RNA酶H活性，最适温度37℃，最适pH7.6，较弱的RNA酶H活性对获得2-3kb的mRNA的全长cDNA有很大好处。在第一链反应前可用氢氧化甲基汞处理，破坏mRNA的二级结构，这一步对于最适反应温度较低（37）℃的鼠源逆转录酶催化的反应可能更为重要。临合成cDNA第一链之前加入过量的巯基试剂，可以使氢氧化甲基汞从RNA上解离。
2．单价阳离子离子条件基本上影响各种模板的转录效率。用钾比用钠离子可获得较长的转录产物。对于cDNA长度的最适钾离子浓度为140-150mM。
3．二价阳离子对于反转录酶活性来说，二价阳离子是必需的。低于4mM Mg2 未能观察到活性；产生全长转录产物的最适浓度是6-10mM。
4．脱氧核苷三磷酸使用四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）中每一种的高浓度对于有效合成cDNA是特别重要的。如果其中只有一种的浓度下降到10-50微摩尔以下，全长转录物的产量将明显下降。常用的dNTP的浓度为200-250微摩尔。
二．材料与方法
1 材料
RNA样品
2 仪器、用具
PCR仪、电泳仪等、0.2mlPCR管（1个）、移液器、碎冰
3 试剂
RNase Free dH2O；5×RT Buffer (含25mM Mg2 )；dNTP (10mM each)；RNase Inhibitor(10U/μl )；Oligo (dT)20 (10μmol/L)；ReverTra Ace
4 方法
(1) 以总RNA为模板，合成cDNA第一链，体系如下：

(2) 反转录反应条件为：30℃ 10min，42℃ 30min ，99℃ 5min，4℃ 5min。反应结束后冰
浴5min。
注意事项：
① cDNA第一链合成的反应液冰上配制。
使用ReverTra Ace、RNase Inhibitor 等酶类时，应轻轻混匀，避免起泡；由于酶保存液
中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。

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