| 赵雨杰 黄宝俊# 徐惠绵# 何群
(中国医科大学生物芯片中心 沈阳 110001 #中国医科大学附属第一医院肿瘤外科 沈阳 110001)
摘 要 为了优化低密度cDNA 芯片杂交最佳条件，并对其杂交的重复性与可靠性进行探讨， 自制低密度cDNA 芯片(14×14)，各靶基因片段长度在189～1078bp 之间，点样浓度在0.5μg/μL 以上， 以SGC7901 胃癌细胞系为待检测标本，分别在不同时间(1、6、12、18 和24h)、温度(37、50、60 和 68℃)下进行杂交检测，比较不同条件的杂交结果。相同芯片对同一标本检测2 次，了解其重复性；应 用RT-PCR 扩增芯片上各靶基因在SGC7901 胃癌细胞系中的表达，与芯片检测结果进行比较分析。结 果表明，随着杂交时间的延长，信号逐渐增强，18h 最强，24h 有所下降(P＜0.001)；杂交温度以60 ℃信号最强，依次为50、68 和37℃(P＜0.001)。重复2 次检测结果差异无显著性(t=-0.941，P=0.348)， 其相关系数为0.588。与RT-PCR 结果相比，相关系数为-0.778(P＜0.0001)，RT-PCR 检测阴性者芯片均未检出荧光信号，特异性为100%；而RT-PCR 检测阳性的20 个基因中芯片上只有16 个基因有荧光信号，灵敏度为80%(16/20)。由此可见，60℃杂交18h 为该自制低密cDNA 芯片的最佳杂交条件，该芯片的重复性与可靠性较好，与RT-PCR 技术相比，特异性很好，灵敏度略差。
关键词 cDNA 芯片 基因表达 杂交条件 重复性 可靠性
Optimization of Low-density cDNA Microarray Hybridizing Condition
and Verification Analysis
Zhao Yujie, Huang Baojun#, Xu Huimian#, He Qun
( The Center of Biochip, China Medical University, Shenyang 110001
# Oncology Department, The First Affiliated Hospital, China Medical University, Shenyang 110001)
Abstract In order to optimize the best hybridizing condition of low-density cDNA microarray
established by the authors and to further discuss the reproducibility and reliability, a low-density cDNA microarray
(14×14) was fabricated, on which the target genes’ length was between 189 and 1078 base pairs, and the concentration was above 0.5μg/μL. SGC7901 gastric cancer cells were used for detection. Different hybridizing time(1h、6h、12h、18h、24h) and temperature (37℃、50℃、60℃、68 ℃) were designed to compare the hybridizing dynamics. All target genes’ mRNA expression in the same cells were detected by the identical cDNA microarray
twice and by RT-PCR for further proving to know the reproducibility and reliability. The longer of hybridizing time, the stronger of signal intensity, a time of 18h was the best and signal intensity decreased after 24h(P<0.001). With respect to the hybridizing temperature, 60℃ was the strongest, and became less at 50℃、68℃、37℃ one by one(P<0.001). There was no significant difference in two repeated detection(t=-0.941，P=0.348), and the correlation coefficient was 0.588. In comparison with RT-PCR, the correlation coefficient was –0.778 (P<0.0001), specificity was 100% and sensitivity 80%. Inconclusion, to hybridize at 60℃ for 18h was the best condition of the low-density cDNA microarray
. The reproducibility and reliability was good. The specificity was superior to RT-PCR and the sensitivity inferior
to it.
Key words cDNA microarray
, Gene expression, Hybridizing condition, Reproducibility,
Reliability
基因芯片技术近年来引起了人们的普遍关注，已在多种领域中进行了研究和探讨[1~6]。其中表达基因芯片应用最为广泛，根据靶基因种类不同可分为寡核苷酸芯片和cDNA 芯片，此两种芯片多是含有几千乃至上万个基因的高密度芯片，多用于细胞、组织、器官等基因表达谱的研究，由于其同时、平行、快速检测的优点，在基因表达谱分析上做出了不可磨灭的贡献。目前研究发现在某一疾病发生发展过程中仅有小部分基因(几十到几百个)表达谱发生变化[7~9]，而高密度基因芯片价格昂贵，且所选基因固定，缺乏个性化，在疾病研究中应用势必造成资源浪费。因此，自行设计构建低密度、个性化、价廉的cDNA 芯片检测技术平台，具有更广阔的应用空间。笔者既往研究发现短片段靶基因(200bp 左右)杂交效果稳定，且与长片段(1000bp 以上)检测结果一致，以50%DMSO 为点样溶液，靶基因浓度在0.5μg/μL 以上者为最佳制作条件[10]。本文在此基础上进一步研究低密度cDNA 芯片的杂交动力学、杂交信号的重复性与可靠性，为该技术的进一步推广应用奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 材料
Micro GrindⅡ基因芯片点样仪(英国)，Gene TAC 基因芯片扫描仪(美国)，PCR 仪(Whatman Biometra)，电泳仪，Chemi Imager 5500 自动电泳凝胶成像分析仪，UV300 紫外分光光度计等仪器；N-甲基吡咯烷酮，琥珀酸酐，Cy5-dUTP(Pharmacia 公司)，SuperscriptⅡreverse transcriptase，AMV 酶逆转录试剂盒(Promega 公司)，TRIzol 试剂盒(Invitrogen 公司)，Taq DNA 聚合酶(华美公司)，杂交缓冲液(上海生工)，氨基片(CEL 公司)等试剂材料。
1.2 方法
1.2.1 低密度cDNA 芯片的制作 选取如下靶基因：beta actin、GAPDH、Heparanase、MMP-2、MMP-7、VEGF-C、S100A4、hRad17、hTERT、TGF-β、CD44s、Integrin-β、CDH1、KAI1、TIMP-1、TIMP-2、PTEN、nm23H1 和乙肝病毒DNA，利用Primer Premier 5.0 软件分别设计RT-PCR 及PCR 引物，片段长度分别在189～1078bp 之间，引物序列参见表1。其中beta actin 和GAPDH为内对照，乙肝病毒DNA 为阴性对照，单纯50%DMSO 点样溶液为空白对照。RT-PCR(以胃癌组织总RNA 为模板)及PCR(以乙肝患者血清DNA 为模板)扩增相应基因片段并纯化，分别溶于50%DMSO，调整各靶基因浓度在0.5μg/μL 以上。芯片布阵为14×14，制作详细步骤参见文献[10,11]。
1.2.2 探针的制备 常规培养SGC7901 胃癌细胞系，TRIzol 试剂盒提取细胞总RNA，紫外分光光度计对RNA 进行定量、定性，1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。取高质量总RNA100μg，逆转录合成第一链cDNA，同时标记荧光素Cy5，然后顺序加入EDTA 终止反应、NaOH 降解RNA、Tris-HCl 中和，并用乙醇沉淀方法纯化，分别溶于20μL 杂交缓冲液。详细过程参见文献[10,11]。
1.2.3 杂交反应动力学研究 以beta actin(189、491 和974bp)及GAPDH(227、552 和1078bp)为靶基因，以 50%DMSO 为点样溶液，调整靶基因浓度在0.5μg/μL 以上，每一基因重复点样3 次，制片20 张。以SGC7901 胃癌细胞系为待检测标本，芯片制作、探针的制备、杂交后荡洗、扫描定量的详细步骤如上述，而对杂交反应时间和温度进行分项研究，每一条件重复实验2 次。
1.2.3.1 杂交反应时间 湿盒内60℃杂交，杂交时间分别为1、6、12、18 和24h，洗涤检测方法不变，比较杂交结果。
1.2.3.2 杂交反应温度 湿盒内杂交时间18h，杂交温度分别为37、50、60 和68℃，洗涤检测方法不变，比较杂交结果。
1.2.4 杂交反应的重复性检验 以上述优化的最佳杂交条件，应用自制低密度cDNA 芯片检测同一标本中各基因的表达，重复检测2 次，比较杂交结果。
1.2.5 杂交反应可靠性检验 RT-PCR 检测上述基因在SGC7901 胃癌细胞系中的表达，产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳(3%浓缩胶和8%分离胶)银染检测，应用Chemi Imager 5500 测定各基因扩增条带平均灰度值(A)，该系统检测灰度值时默认黑为0，白为255，故产量越多，灰度值越低。重复2 次扩增，与芯片检测结果比较。
1.2.6 统计分析方法 利用SPSS 11.5 统计分析软件，采用单因素方差分析比较不同条件下杂交信号的强度，并进行多重比较。杂交信号的重复性采用相关分析及配对均数t 检验，芯片上各基因杂交信号与RT-PCR 检测结果的关系采用相关分析。
2 结果
2.1 不同靶基因片段的纯化及总RNA 的质量监控图1、图2 为各靶基因片段纯化后电泳图，DL2000 及100bp marker 每条带约为50ng，以其为参照，并用紫外分光光度计测定纯化后产物A260，对其浓度进行校对，调整各靶基因浓度分别为0.5μg/μL 以上，由图可见各基因的纯度较好，无明显杂带。提取的胃癌细胞系SGC7901 总RNA 均进行1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，并经紫外分光光度计检测A260/A280 。选取18S、28S条带清晰，比值约1/(2～2.5)，A260/A280 均在1.8 以上的总RNA 进行标记探针。
2.2 杂交反应动力学
2.2.1 杂交反应时间 杂交1h 时各基因未出现荧光信号，杂交时间分别为6、12、18 和24h 时均可见杂交信号，时间增加荧光信号增强，以18h 最强，经方差分析和多重比较发现：24h 与12h之间差异无显著性(P=0.422)；其它信号间差异具有显著性(P＜0.0001)。
图3 为60℃杂交不同时间芯片上各基因荧光强度的均值比较。杂交过程中发现杂交24h 时常出现杂交液干涸，表现为“满天星”现象。
2.2.2 杂交反应温度 不同杂交温度下各基因均可见荧光信号，37℃时荧光信号较弱，68℃时亦常出现杂交液干涸，背景高现象；50℃和60℃均可见较好的杂交信号，以60℃最佳，经方差分析和多重比较发现，各温度间差异均具有显著性(P＜0.0001)。图4 为不同温度杂交18h 各基因荧光强度的均值比较。
2.3 杂交反应的重复性
应用自制低密度cDNA 芯片检测胃癌细胞系SGC7901 中各基因的表达，于湿盒中60℃杂交18h，重复检测2 次，除个别点因杂交液未覆盖外，2 次杂交信号均具有较好的重复性，相关系数为0.588(P=0.0000)。经配对均数t 检验发现两次结果无统计学差异(t=-0.941，P=0.348)。图5为其中一次的杂交图。
2.4 杂交反应的可靠性
cDNA 芯片上荧光强度越高表明该基因mRNA 表达越高，RT-PCR 扩增条带经银染后平均灰度值越大则该基因表达越低。将芯片上各基因的荧光强度均值与RT-PCR 扩增各基因条带平均灰度值进行相关分析，相关系数为-0.778(P＜0.0001)。将芯片杂交检测结果与RT-PCR 检测结果进行比较，RT-PCR 检测阴性者基因芯片均未检出荧光信号，特异性为100%；而RT-PCR 检测阳性的20 个基因中芯片只有16 个基因有荧光信号，灵敏度为80%(16/20)。
3 讨论
差异无显著性，经相关分析得相关系数为0.588，具有统计学意义(P＜0.0000)，但与文献相比相对较低[12,13]。分析其原因，该研究中各基因的荧光强度为均一化后信号强度与背景的差值(即实测值)，数值相对较大(0～98874)，哪怕两次检测数值仅有1%之差，而差值已为百位数；而文献中比较的数据为两次实验中相应的Ratio 值，数值小(多为十位数以下)，因此本研究中相关系数值较低。将芯片检测结果与RT-PCR 检测结果比较，特异性为100%，而灵敏度为80%。RT-PCR 技术指数扩增相应基因片段，因此灵敏度非常高，常出现假阳性现象，而cDNA 芯片检测待检标本的mRNA 经逆转录直接标记荧光，并未进行扩增，虽灵敏度相对RT-PCR 较低，但反映了组织细胞中各基因的真实表达量，因此结果更为可靠。
自行设计构建cDNA 芯片检测技术平台价格低廉、适合我国国情，具有广阔的基础和临床应用前景，如总体评价、验证组织中不同基因表达谱；寻找差异表达的基因；筛选肿瘤特异性标志基因，制作肿瘤诊断的预警芯片；用于肿瘤的分子分期及预后判断；筛选基因药物，确定治疗的分子靶点；评价检测肿瘤放疗、化疗和生物治疗疗效及毒副作用等等，本研究组正在相关方面进行研究和探讨。
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