PCR技术应用七：DMS/BMD基因诊断

　　DMD(Duchenne Muscular Dystrophy)和BMD(Becker Muscular Dystrophy)是一种常见的X连锁隐性遗传病，主要发生于男性，其发病率为1/3500活产男婴，其发生的原因是Dystrophin(抗肌萎缩蛋)其固缺陷所致.

一、DMD/BMD的临床表现

　　在临床上DMD较BMD常见，发病早，症状重，正常于2-3岁即出现骨骼肌无力的表现，一般从骨盒带肌肉无力开始而出现一系列的特殊症状:走路困难呈鸭步，出现Gower's征，腓肠肌进行性肥大.逐渐出现心肌细胞受损，约30%的小儿智能力缺陷.在12岁左右失去能力，至20岁时正常死于呼吸衰竭和心力衰竭.而BMD相对来说症状较轻，进展亦较慢.

二、DMD/BMD的遗传病

　　(一)遗传方式:X-连锁隐性遗传，发病者多为男性，其母亲为致癌基因携带者，尚有1/3的患者为散发病例，则新生突变引起.

　　(二)，DMD/BMD的致病基因:1.基因定位:DMD/BMD是因位于Xq21，其基因非常大约为2400Kb.2.基因结构:该基因共有79个外显子，78个内含子，其CDNA全长约为13974个时，编码的肽链含3685aa残基，编码蛋白命名为dystrophine，其基本5个独立的启动子，在DMD基因内还存在一些STR，已知有13个STR，其中5'端编码区有8个，3'端编码区有1个，44，45，49，30，50内含子各有一个STR，是多为DNDR核心是(CA)n.等位基因数目为2-19个.

三、DMD基因的突变类型

　　(一)缺失与重复:研究表明约65%的DMD/BMD是由于基因内的部分缺失所致，尚有12.5%病例有基因内重复，这种突变变有两个高频发生区，一个在基因的5端，另一个大致在第45～55外显子区域，而5'端的缺失重复热点大致在第1～7外显子区域.缺失的范围从1至数个外显子，甚至整个DMD基因亦可发生缺失，启动子区亦有缺失发生.

　　(二)单碱量换:近年来的研究还发现，在DMD基因内尚有单碱其置换，目前已发现的约有6种，根认为在DMD患者中由此型突变引起者占30%左右.

　　(三)基因内连接形成和mRNA剪接异常:以上两种类型的突变亦在DMD人群中有抗，但因研究的病印例尚少，需要进上步的研究.

四、利用PCR技术诊断DMD的途径

(一)用PCR技术检测缺失型突变.

　　利用PCR可直接检出DMD/BMD的缺失型突变，由于DMD/BMD发生时，其65%的患者为基因缺失所致，因此直接检测缺失可使65%的患者得到诊断.在DMD/BMD基因的缺失中，其缺失范围，缺失的位置具有高度异质性，加之DMD/BMD基因较大，很难用一对引物确定其缺失部位，随着DMD/BMD基因的克隆及其精结构的阐明，有人开发了多时引物进行多重PCR，从而可使几乎全部的缺失型DMD/BMD得到诊断.

　　1.利用6对引物扩增处于缺失热点区域的6个外显子，即外显子8，16，19，44，45和48，再加上外显子4，12，51的3对引物，可检测80%的缺失，若再用Beggs等设计的另外九对引物即外显子3，6，13，46，47，49，50，52，30，60及启动子的引物，进行多重PCR，可使98%的缺失型患者得到诊断，各引物的序列及扩增片段大小见表.

　　在用多重PCR进行DMD/BMD基因的缺失型检测时方便简便，快速，在扩增后，用琼脂糖凝胶电泳溴乙锭染色可根据扩增产物的有无判断结果.扩增时的分清情况见下表:

DMD基因PCR扩增引物

(二)单个碱基置换的检测

　　单碱是置换在DMD/BMD的发生中占有重要地位，但DMD/BMD是因单碱基置换近年来才受到人们的重视，它对发现新突变，确定单碱基置换与DMD/BMD发生的关系具有重要意义，推测的方法主要是用RT-PCR-SSCP及全套式RF-PCR检测.

(三)利用PCR-RFLP和Amp-FLP进行连锁分析诊断DMD/BMD

　　若在一个家庭中，已有一个先证者，则首先利用多重PCR检测其缺失，若不能确定其缺失的部位或不能诊断，或其它条件所限，则可用PCR-RFLP和Amp-FLP进行连锁分析，确定风险染色体.

　　1.PCR-RFLP

　　用多重PCR不能检出非缺失型DMD/BMD患者及携带者，现在可用PCR方法扩增多态性位点区域，同适当的内切酶酶解扩增产物，电泳分离后可对多态性位点进行分布，利用PCR-RFLP连锁分析，即可进行DMD/BMD风险个体的携带者的检出，下表序列即为常用的几个多态性位点检测时的引物及扩增酶解情况.

　　2.AmP-FLP

　　在DMD/BMD基因区内有多个(CA)n重复区域，这些区域可用OCR方法进行扩增，增产物同聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行分析扩增片段大小，然后与先证者及母亲进行对比，亦是检出患者与携带者的理想多态性标记，现将在我国人群中已作分析的(CA)n区引物及多态性片段，PIC列表示下:

　　不应用内含子进行连锁分析时，可用44/49，45/50两组双重PCR同时扩增，亦可在这些组中，将缺失热点的引物加入，形成多复PCR，连锁分机与缺失检测同时进行.

五、DMD/BMD的PCR快速前诊断

　　过去DMD/BMD的PCR快速产前基因诊断主要采用RFLP连锁分析，由于该方法探作复杂费时，提供的信息量有限，因此不能满足临床诊断的要求，目前主要应用PCR法进行产前诊断.

产前快速基因诊断常用以下两种途径

　　1.四步法:

　　(1)性别确定.━━(SRY引物＋DMD课题内对照)

　　(2)先证者缺失型基因检测(多重PCR)

　　(3)胎儿缺失型的确定(多重PCR＋单对引物PCR)

　　(4)Amp-FLP＋PCR-RFLP确定非缺失型式携带者

　　2.一步列位法:董尚志等人在上述方法的基础上建立了一步到位快速法，该系统包括以下三组多重PCR体系.

　　①5'pmCA＋e12＋MP1P

　　②e17＋44CA＋49CA

　　③e17＋45CA＋50CA

　　应用上述三组多重PCR不仅可将女性的两条×染色体分开.而且能检出染色体的.另有一组，SRr＋e44定胎儿性别及44外显子的缺失.一步到位法快速，方便，它不仅能检测缺失，亦可对非缺失型的DMD/BMD进行连锁分析.