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  • CDNA文库筛选

  • 点击:    作者:   来源: 日期:2007-04-10    本站论坛

CDNA文库筛选

(一)λgt11 cDNA文库铺平板

宿主细菌制备

1.用一个E.coli宿主菌株单菌落分别接种2×5ml LB培养基(Y1088用于噬菌斑杂交,Y1090用于免疫筛选),于37℃振荡培养过夜。

2.将过夜培养物以3000×g离心5min

3.分别用2ml λ-dil10 mmol/L tris-Cl,pH7.5; 10 mmol/L MgSO4; 高压灭菌)重悬细胞沉淀。

4.细胞悬液可用于4℃贮存至一周。

预制噬菌体悬液铺平板

以已知滴度(如,已知每ml噬菌体颗粒数)的cDNA文库或其他噬菌体悬液开始,用λ-dil稀释以达到所需每平板噬菌体数。每个90mm直径平皿5×103个噬菌体/100μl开始筛选。

铺平板

1.将所需数量的LB平板置42℃温箱预热。

2.LB顶层琼脂(每平板最少2.5ml)用微波炉熔化,然后置49℃水浴中。

3.为温箱内的每一个平板准备一个12ml带螺旋盖试管,于室温,放在合适的架子上。

4.用移液器每管加100μlλ-dil稀释的宿主细胞悬液。

5.每管加100μl稀释的噬菌体悬液与细菌于漩涡器上简短混合。

6.含细菌和噬菌体(感染混合物)的试管于37℃温育25min,然后室温放置。

7.用一支消毒的10ml

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