CDNA文库筛选
(一)λgt11 cDNA文库铺平板
宿主细菌制备
1.用一个E.coli宿主菌株单菌落分别接种2×5ml LB培养基(Y1088用于噬菌斑杂交,Y1090用于免疫筛选),于37℃振荡培养过夜。
2.将过夜培养物以3000×g离心5min。
3.分别用2ml λ-dil(10 mmol/L tris-Cl,pH7.5; 10 mmol/L MgSO4; 高压灭菌)重悬细胞沉淀。
4.细胞悬液可用于4℃贮存至一周。
预制噬菌体悬液铺平板
以已知滴度(如,已知每ml噬菌体颗粒数)的cDNA文库或其他噬菌体悬液开始,用λ-dil稀释以达到所需每平板噬菌体数。每个90mm直径平皿5×103个噬菌体/100μl开始筛选。
铺平板
1.将所需数量的LB平板置42℃温箱预热。
2.LB顶层琼脂(每平板最少2.5ml)用微波炉熔化,然后置49℃水浴中。
3.为温箱内的每一个平板准备一个12ml带螺旋盖试管,于室温,放在合适的架子上。
4.用移液器每管加100μlλ-dil稀释的宿主细胞悬液。
5.每管加100μl稀释的噬菌体悬液与细菌于漩涡器上简短混合。
6.含细菌和噬菌体(感染混合物)的试管于37℃温育25min,然后室温放置。
7.用一支消毒的10ml
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