差减cDNA文库法
[第一条链cDNA合成]
1．合成第一条cDNA链时，所有试剂应按下列顺序依次加入：
10×第一条链合成缓冲液 5.0μl
10mM dNTP Mix(1.4μg/μl) 2.5μl(终浓度1.25mM)
Linker primer(1.4μl，终浓度100μg/μl)
DEPc H2O
RNase block Ⅱ(1U/μl) 1.0
mRNA 1~5μg
混合，离心20秒钟，室温放置10分钟
2．加入逆转录酶至1500U/ml，补水到终体积50μl。
3．混合，取出5μl放入含有0.5μg α-32P dATP（800Ci/mM），分别保温在37℃ 1小时。
4．保温后，带有同位素的离心管放入-20℃保存，为以后分析用。第一条链cDNA混合物放在冰上。
[第二条cDNA链的合成]
1．对于总体积为45μl的第一条链混合物按下列次序依次加入：
第一条链混合物 45.0μl
10×第二条链缓冲液 20.0μl
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